Uso de parámetros de evaluación seminal como indicadores de daño causado por patógenos de la reproducción

CACCIATO C.S.; CHIAPPARRONE M. L; CATENA M.; CAGNOLI C.; SOTO P.

San Salvador de Jujuy

Congreso; XXI Reunión Científico Técnica Dr. Bernardo Carrillo, AAVLD; 2016

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico

Introducción. El análisis seminal de rutina en los bovinos tiene como objetivo predecir la fertilidad y la capacidad fecundante del toro. Dentro de los parámetros más frecuentemente evaluados se encuentran: concentración, motilidad, morfología, vitalidad espermática, integridad y funcionalidad de la membrana plasmática. Otros parámetros que pueden evaluarse son el daño del ADN y la integridad acrosomal. La integridad de la membrana plasmática y del acrosoma, son dos de los parámetros más importantes debido a que la membrana es fundamental para el metabolismo del espermatozoide e imprescindible en varios eventos involucrados en la fecundación, como son la capacitación, la reacción acrosómica y la fusión con el oocito.La evaluación de estos parámetros puede utilizarse no sólo para medir la calidad seminal con fines reproductivos, sino también para determinar el daño que puede causar un agente infeccioso sobre los espermatozoides en un modelo experimental.El objetivo del presente trabajo fue la puesta a punto de diversas técnicas para medir el daño espermático causado por la adhesión de Campylobacter fetus. Materiales y métodos. Para la puesta a punto de las técnicas, se utilizaron cinco pajuelas comerciales de semen criopreservado. Tres fueron desafiadas con Campylobacter fetus para el desarrollo de un modelo experimental. El semen fue incubado en medio SOF con heparina en estufa a 38 ºC con 5% CO2 durante 24 h, para inducir la capacitación espermática. Las técnicas utilizadas fueron: coloración vital eosina-nigrosina, test hiposmótico (HOST), coloración Trypan Blue/Giemsa y el test de la dispersión de la cromatina (SCD). La tinción EOSINA-NIGROSINA se utilizó para evaluar la integridad estructural de la membrana plasmática. Se basa en la permeabilidad a la eosina de las membranas de los espermatozoides muertos, por lo tanto, los espermatozoides vivos no se teñirán, mientras que los muertos se verán coloreados. Para realizar esta técnica se colocó una alícuota de semen en un portaobjeto sobre platina térmica a 37ºC. Se agregó la eosina, se homogeneizó y posteriormente se añadió nigrosina y realizó el extendido. La observación se realizó en microscopio óptico (40X) y se efectuó un conteo de espermatozoides vivos y muertos.El test HOST se utilizó para evaluar la funcionalidad de la membrana espermática. Se basa en la semipermeabilidad de las membranas plasmáticas intactas y bioquímicamente activas de los espermatozoides vivos, que les permite absorber líquido y expandirse en situaciones hiposmóticas. Al exponer los espermatozoides a una solución con dicha característica, la cola se ?hincha?, lo que indica el movimiento de agua a través de la membrana para lograr el equilibrio. Así, los espermatozoides con la membrana intacta y con los mecanismos de intercambio de fluidos en correcto funcionamiento, se observarán con la cola ?enrollada?. En esta prueba se incubó el semen en un medio hiposmótico (citrato de sodio y fructosa, 150 mOsm/L) en baño María a 37 ºC durante 30 min. La observación se realizó en microscopio de campo oscuro (40X), los flagelos enrollados o acodados, parcial o totalmente se consideraron reacciones positivas. La coloración TRYPAN BLUE/GIEMSA fue utilizada para determinar la integridad y la reacción acrosómica. En esta técnica se colocó una alícuota del semen sobre un portaobjeto y se añadió el colorante Trypan Blue en una concentración del 0.27%, realizando un extendido. Luego del secado se sumergió en Giemsa durante 24 h. La observación se realizó en microscopio óptico (100X), considerando como activados a aquellos espermatozoides que poseían alteraciones en la membrana acrosómica.Para evaluar la fragmentación del ADN se utilizó el test SCD. El fundamento de la técnica es la remoción de las proteínas mediante soluciones de lisis, con la consecuente formación de ?loops? de ADN que se observan como un halo periférico alrededor de una estructura nuclear residual o ?core?. Los espermatozoides con elevada fragmentación de la cromatina no producen halo de dispersión, en cambio los espermatozoides con ADN intacto forman halos extensos. Los espermatozoides fueron incluidos en portaobjetos con una matriz de agarosa y tratados con una solución ácida de HCl para desnaturalizar el ADN. Posteriormente, se utilizaron dos soluciones de lisis para remover las membranas y proteínas. El efecto fue visualizado por la tinción 4´,6-diamino-2-fenilindol (DAPI).Resultados. Se lograron poner a punto los protocolos de las técnicas mencionadas con las siguientes modificaciones: para el caso del test HOST el tiempo fue ajustado a 60 min para una mejor observación del efecto. En la coloración TRYPAN BLUE/GIEMSA la tinción de Giemsa se realizó en estufa a 37ºC durante dos horas para acelerar la reacción. De esta manera se obtuvo una mejor tinción y menor cantidad de precipitado del colorante, facilitando la visualización. En el test SCD se utilizó Mercapto-Etanol en la solución de lisis, en vez de DTT como cita la bibliografía, obteniéndose resultados adecuados. Mediante estas técnicas se pudieron observar diferencias entre los espermatozoides tratados con Campylobacter fetus y los controles, en la integridad y la funcionalidad de la membrana.Discusión. Estas técnicas permitieron determinar el daño espermático causado por Campylobacter fetus y podrían ser aplicadas en modelos experimentales para otros patógenos, además de su uso habitual en reproducción.