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ResumenLa glicoproteína del virus de la rabia es responsable de la unión a la superficie celular del huésped e induce la producción de anticuerpos neutralizantes. En el presente estudio, el gen la de glicoproteína del virus de la rabia (cepa CVS) fue clonado, secuenciado y expresado en la levadura Pichia pastoris como una proteína secretada, utilizando una estrategia de alimentación de metanol tipo DO-STAT. La alimentación se programó de manera de garantizar en todo momento un nivel de oxígeno disuelto en torno al 40 % del nivel de saturación en el medio de cultivo sintético utilizado. La expresión de la glicoproteína se evaluó mediante ELISA, SDS-PAGE y Western Blot. La glicoproteína recombinante obtenida fue reconocida por anticuerpos específicos al virus de la rabia, al igual que la glicoproteína viral. Se compararon los datos obtenidos con los de trabajos similares y se observaron mejoras en los tiempos de expresión y en la ausencia de actividad proteolítica. Estos datos indican que la glicoproteína viral puede ser expresada en forma recombinante de una manera sencilla y puede purificarse fácilmente al ser secretada. Este método podría utilizarse para la obtención segura de antígeno viral en la producción de kits de diagnósticos y vacunas a subunidad para prevenir la enfermedad.Palabras clave Pichia pastoris, DO-STAT, Virus de la rabia, glicoproteína G.1. IntroducciónLa rabia es una enfermedad viral que causa una forma letal de encefalomielitis en seres humanos y animales susceptibles al virus. La principal vía de transmisión es mediante mordedura de un perro rabioso. El control de la rabia canina se puede lograr a través de programas de vacunación masiva de los animales y la eliminación de perros callejeros.Pichia pastoris (P. pastoris) es una levadura muy utilizada actualmente como sistema de expresión de proteínas recombinantes debido a su fácil manipulación genética, el alto nivel de producción que puede obtenerse de la proteína de interés, la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales similares a las de los organismos eucariotas superiores (glicosilación, puentes disulfuro y procesado proteolítico). Además, posee una secuencia señal de secreción de la proteína heteróloga en el medio que permite purificarla fácilmente. Este sistema de expresión emplea vectores de integración que generan una estabilidad génica incluso en procesos a gran escala. Los cultivos se realizan con medios mínimos, sencillos, económicos, y son escalables. Todas éstas características hacen a P. pastoris un sistema de expresión óptimo para la producción de glicoproteínas virales.El objetivo del trabajo fue expresar la glicoproteína del virus de la rabia en P. pastoris mediante una estrategia de alimentación de metanol en DO-STAT.2. Metodología Se extrajo el ARN viral a partir de la cepa vacunal CVS y se utilizó como molde para amplificar, por RT-PCR, la secuencia nucleotídica que codifica para la glicoproteína. El producto de amplificación fue ligado pPIC9, con el inserto colocado bajo el control del promotor AOX1 (inducible por metanol) y fusionado a una secuencia de exportación capaz de secretar la proteína al medio de cultivo. La secuenciación arrojo un valor superior al 99 % de homología al ser comparada con otras secuencias de la glicoproteína G. El plásmido obtenido fue linealizado enzimáticamente y utilizado para transformar P. pastoris GS115 mediante electroporación. El gen clonado se secuenció y se hizo el análisis de secuencia para corroborar su identidad frente a una base de datos. Se realizaron cultivos en pequeña escala tomándose muestras de sobrenadante para evaluar la expresión de la glicoproteína. Se midió el nivel de expresión mediante ELISA para seleccionar el clon a utilizar en cultivo en fermentador de 4 litros de volumen de trabajo. Se realizó un batch alimentado con glicerol como sustrato inicial y metanol como sustrato de alimentación. Se utilizó una estrategia de alimentación con metanol en forma DO-STAT, de manera de garantizar en todo momento un nivel de oxígeno disuelto en torno al 40 % del nivel de saturación en el medio sintético utilizado. La expresión de la glicoproteína se evaluó mediante SDS-PAGE y Western Blot.3. ResultadosEl gen de la glicoproteína G del virus rábico, cepa vacunal CVS, fue ligado al vector pPIC9 e introducido en P. pastoris GS115. Se realizaron cultivos en pequeña escala y se midió el nivel de expresión mediante ELISA. El clon con mayor nivel de expresión fue seleccionado para un cultivo batch alimentado en fermentador utlizando una estrategia de alimentación DO-STAT. De esta manera, se logró evidenciar a las 24 horas de alimentación, mediante SDS-PAGE, la expresión de 5 mg/l de glicoproteína. A las 48 horas de inducción, se detectaron 10 mg/l de la misma. La glicoproteína recombinante fue reconocida por anticuerpos específicos en un ensayo de Western Blot.4. DiscusiónCon el propósito de evaluar la conveniencia de utilizar una alimentación DO-STAT en un cultivo de P. pastoris de alta densidad, se estudió la producción de la glicoproteína del virus rábico.En el sistema de expresión de P. pastoris el oxígeno disuelto y la concentración de metanol en el medio de cultivo son los parámetros más importantes para lograr una expresión eficiente [1]. Para minimizar la degradación proteolítica y mejorar la expresión proteica, eliminando la fermentación anaeróbica y la producción de formaldehido debido a la acumulación de metanol, se utilizó la estrategia de alimentación DO-STAT. De este modo, se aseguro un nivel de oxigeno disuelto en torno al 40% del valor de saturación y se logró realizar un cultivo de alta densidad sin limitación de oxígeno ni acumulación de metanol.A diferencia de lo descrito por Nagesha et al [2], quienes observaron niveles de expresión a las 108 horas de alimentación, sólo 24 horas de alimentación fueron necesarias en este trabajo para detectar a la glicoproteína recombinante expresada. Además no se observó degradación proteica, dado que la concentración de la glicoproteína expresada fue duplicada a las 48 horas de alimentación, a diferencia de la degradación descrita por Nagesha et al. Por otro lado, el nivel de expresión alcanzado es 7 veces mayor al descripto por Ben Azoun et al [3].5. ConclusionesLa estrategia de cultivo DO-STAT utilizada en este estudio podría ser eficaz como método de alimentación en cultivos de alta densidad celular de P. pastoris, cuando se observa degradación proteolítica. Los resultados muestran que se puede lograr una expresión adecuada de la glicoproteína de la rabia en tiempos de inducción cortos. Esta estrategia permite reducir el tiempo de cultivo, minimizando el costo del bioproceso. Debido a que no se observó degradación proteolítica, tiempos de inducción más largos podrían ser probados para lograr una mayor expresión.Este método podría utilizarse como obtención segura de antígeno viral en la producción de kits de diagnósticos y vacunas a subunidad para prevenir la enfermedad.