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ROL DE LAS GTPASAS EN LA NODULACIÓNAna Claudia Flores, Virginia Savy, Virginia Dalla Via, Ulises Mancini, María Eugenia,Zanetti Flavio BlancoInstituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM). Fac Cs Exactas, UNLP, CCT-La Plata CONICETLas leguminosas son capaces de establecer relaciones simbióticas con rizobios del suelo, los cuales pueden fijar nitrógeno molecular y en formas asimilables para la planta. En condiciones de escasez de nitrógeno en el suelo, el rizobio infecta la raíz de la planta e induce la formación de un nuevo órgano lateral en la raíz, el nódulo, donde tiene lugar la fijación. Esta interacción se inicia por el intercambio de señales entre la planta y la bacteria que, mediante la activación secuencial de diversos genes, conducen al proceso de nodulación. La percepción del factor de nodulación sintetizado por el rizobio (factor Nod) dispara eventos de señalización capaces de generar cambios morfológicos en células epidérmicas y, al mismo tiempo, la activación de la división celular en el córtex, lo cual lleva a la organogénesis del nódulo (Oldroyd y Downie, 2008). Luego de esta comunicación química inicial, la bacteria se une al pelo radical por medio de la interacción de lectinas de la planta con polisacáridos de la superficie bacteriana (Diaz et al. 1995; Smith et al. 1992). El crecimiento polar en el extremo de la raíz se redirecciona, atrapando la microcolonia atrapada en unas estructuras llamadas ?shepherd´s crooks? (Esseling et al. 2003). Las bacterias penetran el pelo radical por un canal que resulta de la invaginación de la pared y membrana de las células epidérmicas, formando el hilo de infección, que avanza hacia las células corticales. En estas células se liberan los rizobios, y se alojan intracelularmente rodeados por una membrana derivada del hospedadorendocitosis en estructuras llamadas simbiosomas. La deposición del material de la pared celular para la formación del hilo es un proceso exocítico dependiente del tráfico de vesículas intracelulares reguladas por pequeñas GTPasas. Las GTPasas monoméricas (también denominadas GTPasas pequeñas) están incluidas en la superfamilia Ras, que consta de 5 familias, Ras, Rab, Rho, Arf y Ran (Kahn et al.,1992; Vernoud et al., 2003). La familia Ras, ausente en plantas, regula la proliferación celular en levaduras y mamíferos; las GTPasas Rho controlan la organización de los filamentos de actina; las GTPasas Arf y Rab participan en distintas etapas del tráfico entre membranas, mientras que las GTPasas Ran regulan el transporte de proteínas y RNA a través de la membrana nuclear.Las GTPasas monoméricas se activan mediante su unión a GTP y se inactivan por la hidrólisis del GTP a GDP, conformando un ciclo que requiere a su vez de proteínas accesorias. La activación de las pequeñas GTPAsas requiere de la proteína GAPs (GTPase-activating proteins), una familia de proteínas que promueven la hidrólisis de GTP a GDP unido a las ellas, mientras que las proteínas GEFs (guanine nucleotide exchange factor) son las que catalizan la remoción del GDP y lo reemplazan por GTP, regulando así su actividad. La expansión de las familias génicas de GTPasas monoméricas de plantas ha llevado a la hipótesis de que esta radiación evolutiva estaría acompañada de una neofuncionalización, incluyendo procesos específicos del crecimiento polar, tales como la elongación del pelo radical y el proceso de infección durante la nodulación (Bayram 2009). Yuksel y Memon intentaron identificar GTPasas que funcionen específicamente o principalmente en la nodulación (Yuksel and Memon, 2008). El análisis comparativo de secuencias EST de nódulos de Medicago truncatula y Lotus japonicus con plantas no leguminosas mostró 10 GTPasas monoméricas, de las cuales 7 pertenecían a la familia Rab, todas posibles candidatos regulatorios del tráfico de materiales entre simbiontes. Sin embargo, se ha observado que los genes requeridos para la respuesta al factor Nod tienen sus ortólogos en plantas no leguminosas, por lo que la especificidad de funciones en la nodulación no necesariamente se encuentra asociado a proteínas específicas de leguminosas o con alta diversificación de su secuencia.El objetivo general de este trabajo es profundizar el conocimiento sobre las GTPasas de leguminosas y su rol en la simbiosis. Para ello nos propusimos identificar las GTPasas monoméricas en el genoma de plantas leguminosas y compararlas con plantas no leguminosas. Asimismo, pretendemos analizar y comparar los perfiles los datos de expresión de las GTPasas monoméricas disponibles en las bases de datos. Para el análisis comparativos de las GTPAsas monoméricas en legunosas y no leguminosas se seleccionaron cuatro especies de cada grupo. Como representantes de las leguminosas elegimos M. truncatula, Glycine max (soja), Phaseolus vulgaris (poroto) y L. japonicus, y para el grupo de no leguminosas Arabidopsis thaliana, Oriza sativa (arroz), Solanum lycopersicum (tomate) y Zea mays (maíz).Se utilizaron las secuencias correspondientes a los genes Rab, Arf, Rop y Ran de A. thaliana reportadas en trabajos anteriores (Rutherford and Moore, 2002; Vernoud et al., 2003) para buscar los homólogos en el genoma de las especies leguminosas y no leguminosas seleccionadas utilizando la herramienta BLAST y la base de datos online Phytozome (http://www.phytozome.net/) para obtener las GTPasas monoméricas de cada una de las especies mencionadas arriba. El análisis filogenético se llevó a cabo con el programa MEGA7. A partir de este análisis se observó que si bien hay variaciones en el número de miembros, la distribución de cada subfamilia de GTPAsas es similar en todas las especies, no hallándose diferencias significativas que puedan correlacionarse con procesos evolutivos específicos dentro de los grupos de leguminosas o no leguminosas. Para identificar el patrón de expresión de los miembros de las cuatro subfamilias de GTPAsas en la nodulación y con de objetivo de analizar si estos patrones de expresión contribuyen a la especificidad de función del proceso realizamos un análisis de los datos disponibles en bancos de datos para cada especie de plantas leguminosas y no leguminosas. Se colectaron datos de RNAseq y/o microarreglos de diferentes tejidos de la planta, incluyendo semillas, hoja, raíz en todas las especies y raíces inoculadas con rizobios y nódulos en leguminosas. La comparación de datos de expresión no mostró diferencias significativas en la proporción de miembros de cada subfamilia que se expresa en los diferentes órganos de la planta. El análisis detallado de los datos de expresión se centró en los datos de M. truncatula debido a la existencia de información espacial derivada de la microdisección laser de las diferentes partes del nódulo. Los datos disponibles fueron obtenidos por secuenciación masiva sobre muestras de nódulos de 15 días post inoculación correspondiente a las zonas FI, ZII, IZ y ZIII. Observamos que en la zona meristemática enriquecida en células indiferenciadas (ZI) se halla la mayor expresión de los genes de la subfamilia RAB Medtr1g062760, Medtr2g075950, Medtr3g086980, Medtr8g027220 y ROP Medtr6g087980. Contrariamente, en la interzona (IZ) y la zona de fijación (ZIII) se halla concentrada la expresión de la RAB Medtr7g103070 y la ARF Medtr2g090875. Esta expresión espacio-temporal de las distintas GTPAsas podría estar asociada con la especificidad de función de las mismas en el proceso de nodulación.Será necesario completar el análisis de los patrones de expresión de las distintas GTPAsas en el resto de las especies seleccionadas para profundizar el estudio del rol de las GTPAsas en el proceso de nodulación.