Detección Antígénica del Trypanosoma evansi en Suero de Equinos Mediante un Test ELISA con Anticuerpo Monoclonal

MONZON,C.M

UNIVERSIDAD DEL SALVADOR (USAL)- Buenos Aires

Jornada; Jornada de Actualización en Parasitologia y Entrega de Premios AAPAVET " Dr. KURT WOLFFUGEL"; 2005

Asociacion Argentina de Parasitologia

Detección Antigénica de Trypanosoma evansi en Suero de Equinos Mediante un Test ELISA con Anticuerpo Monoclonal   Carlos Manuel Monzón(*)   (*) Centro de Diagnóstico e Investigaciones Veterinarias (CEDIVEF). Investigador Adjunto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Profesor Titular Cátedra de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud - Universidad Nacional de Formosa (U.Na.F.).   E-mail cedivef@satlink.com.     Resumen   Se describe la producción de anticuerpos monoclonales (AcM) anti Trypanosoma evansi, la caracterización y la aplicación de uno de ellos en una prueba inmunoenzimática de diagnóstico, basada en la detección de antígenos circulantes (ELISA–Ag) en suero.   Fusionando celulas de mieloma NSO con esplenocitos de ratones Balb/c inmunizados con un homogenado de T.evansi se obtuvieron hibridomas productores  de AcM. Estos híbridos se clonaron tres veces por el método de dilución límite. El fluido de los cultivos fue cosechado y concentrado diez veces por precipitación con sulfato de amonio. La clase de inmunoglobulina fue determinada por ELISA o doble inmunodifusión.   Basándose en ensayos de sensibilidad y especificidad un AcM del tipo IgM denominado 2-4F6 fue seleccionado para su aplicación en la prueba para detección de antígenos. Empleando electroforesis en gel de poliacrilamida y western blot, se comprobó que este AcM reacciona sobre dos bandas antigénicas, una de 85 y otra de 122 kDa, ambas provenientes de componentes internos del parásito.   Se investigaron las reacciones cruzadas antígeno-anticuerpo entre T.evansi, Trypanosoma cruzi, Babesia equi y B.caballi, protozoos que coexisten en la población de equinos en el sub-trópico de Argentina. Se evaluó con estos antígenos la especificidad del AcM 2-4F6 en tres pruebas serológicas. En una prueba ELISA para anticuerpos el antígeno T.evansi presentó reacción con el suero positivo para T.cruzi y B.equi; T.cruzi, a su vez, reaccionó positivamente con T.evansi y con B.equi. Este último reaccionó con el suero anti T.evansi y llamativamente no mostró reacción con B.caballi. No obstante B.caballi reaccionó positivamente con los inmunosueros para B.equi y T.evansi. El AcM 2-4F6 mostró una intensa reactividad con el antígeno T.evansi, pero contrariamente, la reacción fue francamente negativa con los restantes antígenos. En un test de inhibición, el antígeno T.evansi, en concentraciones de 4 a 512 mg/ml de proteína, bloqueó la actividad del AcM 2-4F6 entre un 84 a 92%, mientras que idénticas concentraciones de los antígenos heterólogos, no produjeron inhibición significativa. La prueba ELISA-Ag fue negativa al emplearse los homogenados antigénicos heterólogos en concentraciones desde 4 hasta 512 mg de proteínas por ml. Por el contrario, la reacción fue francamente positiva a idénticas concentraciones con el antígeno T.evansi.   ______________________________________ Trabajo financiado con aportes de la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica – PICT 2000 –          N° 08-08667 y del Grupo de Investigación del CONICET en el Centro de Diagnóstico e Investigaciones Veterinarias Formosa-CEDIVEF. Se describe el desarrollo  y evaluación de una  prueba ELISA  para diagnóstico del T.evansi en equinos, basada en la detección de antígenos circulantes en suero .Se  empleó como captura de antígenos un suero policlonal  consistente en IgG-IgM de cabra anti T.evansi; como reactivo primario de detección el AcM 2-4F6 y secundariamente anti IgM de ratón (cadena m) preparada en cabra y conjugada con peroxidasa.   En un equino con infección experimental, la detección de los antígenos en suero se hizo evidente hacia el día 16 post-infección, posteriormente mostró  elevados niveles de antígenos inclusive en los períodos de parasitemia en relapse. La prueba permaneció positiva tras el fracaso de un primer tratamiento con Diminazene y ante la efectividad de un  tratamiento con Suramina los antígenos alcanzaron los niveles de pre-infección 30 días mas tarde, indicando su utilidad para evaluar la eficacia del tratamiento farmacológico administrado. La prueba fue a su vez evaluada con muestras de sueros de 156 equinos de cuatro tropillas infectadas con T.evansi; de los cuales 86 fueron positivos al diagnóstico parasitológico (DP) por los métodos estándar de detección (microhematocrito e inoculación de sangre en ratones). Se emplearon como controles 50 sueros equinos de la zona enzoótica y 269 de la zona libre al parásito, todos negativos para anticuerpos contra el T.evansi.   Los resultados de la prueba fueron expresados en porcentaje de positividad (PP) con relación a un suero control positivo de referencia. La diferencia entre una prueba positiva y una negativa se basó en el histograma de distribución de frecuencias confeccionado sobre la base de los resultados de los animales infectados versus no infectados. Un 15% de positividad dio una sensibilidad del 81% para un intervalo de confianza(IC) al 95% del 71% al 88% y especificidad del 98%, IC entre el 95.5% y 99.3%. Estadísticamente se comprobó asociación entre equinos enfermos y prueba positiva ELISA-Ag; X2 = 48.6 (P 0.000); índice Kappa = 0.83 IC 95%: 0.76-0.90 (P=0.000). El coeficiente de variación (CV) entre ensayo expresado en PP para el CP++, CP+ y CN fue del 5,4%, 10.6% y 43%, mientras el CV intra-ensayo fue del 3.8%, 5.3% y 8.7% respectivamente, para cada uno de los sueros.   En los cuatro grupos de equinos con T.evansi, ELISA-Ag fue positivo en 70 de los 86 equinos con parásitos (81%). En forma interesante, según las tropillas analizadas, la prueba fue positiva en el 31% (DS 11%)) de los equinos que resultaron negativos al diagnóstico parasitológico. Una combinación entre ELISA-Ag y DP detectó como infectados 104 animales, indicando que la utilización de ambos métodos incrementa la sensibilidad del diagnóstico.   Este trabajo constituye el primer reporte sobre producción y caracterización de un anticuerpo monoclonal para T.evansi proveniente de Argentina. Los resultados obtenidos y la información generada indican la utilidad del test ELISA-Ag basado en el empleo del AcM 2-4F6 para diagnóstico del T.evansi en equinos del área sub-tropical de Argentina.   __________________________________   Palabras Claves: Trypanosoma evansi, anticuerpo monoclonal, antígenos, equinos, Argentina