Láminas de polilactato sembradas con mioblastos diafragmáticos que sobreexpresan conexina 43. Sus efectos cardioprotectores en un modelo ovino de infarto agudo de miocardio. Resultados preliminares

GIMÉNEZ CARLOS SEBASTIÁN; LOCATELLI PAOLA; DEWEY RICARDO; MONTINI BALLARIN FLORENCIA; ABRAHAM GUSTAVO; ORLOWSKI ALEJANDRO; DE LORENZI ANDREA; BAUZÁ MARIA DEL ROSARIO; NEIRA SEPÚLVEDA ANGELA; IRALA ALBERTO; EMBON MARIO; CUNIBERTI LUIS; OLEA FERNANDA DANIELA

La Plata

Congreso; Congreso de la Sociedad Argentina de Fisiología; 2016

Sociedad Argentina de Fisiología

Introducción:Las enfermedades cardiovasculares siguen siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad del mundo, superando a las enfermedades infecciosas y oncológicas.La enfermedad cardiovascular más frecuente y con mayor mortalidad es la cardiopatía isquémica. Su complicación más severa es el infarto agudo de miocardio (IAM), caracterizado por pérdida de tejido contráctil y reemplazo por tejido fibrótico. Con el tiempo, estos eventos conducen al desarrollo de insuficiencia cardíaca cuyo tiempo medio de sobrevida es de 4 años.Con el objeto de restaurar la funcionalidad de corazones que han sufrido infarto y disminuir la necesidad de trasplantes, la cardiomioplastía (implante de células madre) se está investigando como una alternativa. Para este fin se han utilizado células madre de diferentes orígenes y potencialidades evolutivas, entre las que se encuentran los mioblastos del músculo esquelético, también conocidas como ?células satélite? o ?mioblastos?. Se ha sugerido que el potencial de diferenciación de los mioblastos podría variar según su músculo de origen, siendo las características fisiológicas de éste uno de los factores más importantes a tener en cuenta. Dado que el diafragma se compone de fibras tipo I de gran resistencia al estrés y alto umbral de agotamiento que le permite contraerse unas 20 veces/min durante toda la vida, los mioblastos diafragmáticos (MDs) serían más adecuados que los de otros músculos esqueléticos para terapias cardio-regenerativas. De esta manera, nos propusimos aislar, cultivar y caracterizar MDs ovinos, transducirlos con el gen de conexina 43 (cx43) para promover la conexión entre células, y crecerlos sobre láminas de polilactato (PLA) para la aplicación posterior de estas láminas sobre áreas infartadas en un modelo ovino de IAM.Métodos:Todo procedimiento se realizó de acuerdo a la Guía para el Uso y Cuidado de Animales de Laboratorio (NIH publication No. 85-23, revised 1996) y bajo aprobación del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL).En ovejas Corriedale de 30-40 kg de peso se obtuvieron biopsias de diafragma de 1 a 2 cm2 por minitoracotomía derecha estéril bajo anestesia general. Las muestras recolectadas fueron digeridas con colagenasa. Los MDs extraídos se cultivaron sobre un feeder layer de macrófagos autólogos activados, y se caracterizaron con anticuerpos anti-desmina, α-actina sarcomérica, SERCA-2-ATPasa, MyoD y miosina de cadena pesada para músculo esquelético (MHC) y por su capacidad de diferenciarse a miotubos.Se desarrolló un vector lentiviral portador del gen de cx43 y de la proteína verde fluorescente bajo la regulación de un promotor de citomegalovirus, con el cual se transdujeron MDs, previa medición por citometría de flujo de la eficiencia de transducción de diversas multiplicidades de infección (MOI).La expresión de cx43 fue corroborada por Western blot en MDs con la modificación génica (MDcx43), y en miotubos obtenidos de su diferenciación. Además, se estudió viabilidad celular por absorbancia mediante kit comercial. Láminas de PLA de aproximadamente 50 μm de espesor fueron diseñadas y desarrolladas por electrospinning, técnica que permite alinear las fibras del biopolímero y así promover el ordenamiento paralelo de los MDs al ser cultivados sobre las láminas, lo cual, a su vez, aumenta el área de contacto entre células, favoreciendo la comunicación por cx43. A continuación, las ovejas previamente biopsiadas fueron reoperadas para provocar un IAM ánteroapical por toracotomía izquierda estéril bajo anestesia general. Láminas cultivadas con MDcx43 autólogos (grupo PLA-MDcx43; n=4) y láminas no cultivadas (grupo PLA; n=4) fueron suturadas cubriendo el infarto y 1 cm del miocardio no infartado adyacente.El tamaño de infarto inicial y final (3 y 45 días post-IAM, respectivamente) se midió por resonancia magnética nuclear (RMN) con realce tardío (gadolinio), técnica que permite comparar los tamaños de infarto en forma apareada. Previo al IAM (día 0) y a los 3 y 45 días del mismo se midió la fracción de eyección (FE%) del ventrículo izquierdo (VI) por ecocardiografía bidimensional bajo sedación leve.Resultados:La eficiencia de transducción fue de 70,81% con un MOI=100. La viabilidad celular, expresada como % relativo a MD no transducidos, no se alteró a causa de la manipulación genética (MD sin transducir: 100,0 ± 9,475%: n=6; MDcx43: 95,55 ± 7,267%: n=6; p=NS; X ± SD; test t).El tamaño de infarto, expresado en ml de tejido infartado, disminuyó en el grupo PLA-MDcx43 de 8,0 ± 1,83 ml al día 3 a 6,25 ± 2,2 ml al día 45 (p