Efecto de las condiciones de operación sobre la maceración de albedo de pomelo con Protopectinasa-SE de Geotrichum klebahnii

SAINZ, R.B.; ZAPATA ZAPATA, A.D.; CAVALITTO, S.F.; HOURS, R.A.

Bogotá, Colombia

Congreso; III Congreso Colombiano de Biotecnología y II Seminario Internacional de Bionegocios; 2008

Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia

La maceración, un proceso utilizado en la industria de alimentos, consiste en la desintegración de tejidos vegetales con el objeto de producir pulpas de frutas y vegetales para ser utilizados como ingredientes en alimentos para bebés y ancianos. Diferentes técnicas de maceración han sido utilizadas, entre las cuales la maceración enzimática ha cobrado gran importancia ya que permite la obtención de células independientes que conservan su integridad, manteniendo en su interior los nutrientes propios del tejido. Por otro lado, en los procesos de maceración química o mecánica el rompimiento celular hace que las propiedades nutritivas de los tejidos se vean afectadas negativamente. La maceración enzimática se produce por la acción combinada de enzimas que degradan la lámina media (o material cementante) de los tejidos, la cual está compuesta principalmente de protopectina y otros polisacáridos. Protopectinasa-SE (PPasa–SE) es una enzima expresada por el hongo levaduriforme Geotrichum klebahnii que hidroliza la protopectina presente en los tejidos, liberando de esta forma pectina soluble y permitiendo así la separación de las células sin mayores daños. La aplicación de la PPasa-SE en el proceso de maceración de tejidos vegetales permitirá aprovechar, mediante tratamientos biotecnológicos innovadores y de bajo impacto ambiental, los residuos agrícolas provenientes principalmente de industrias de cítricos, los cuales contienen una alta concentración de compuestos fitoquímicos benéficos para la salud humana. Por su alto nivel de producción en Argentina y su alto contenido de vitaminas y flavonoides, el pomelo es un interesante modelo de estudio del proceso de maceración enzimática. El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto que muestran diferentes condiciones de operación; temperatura, concentración de buffer citrato, pH y fuerza iónica, sobre el proceso de maceración de albedo de pomelo (Citrus paradisi), en cuanto a la cantidad y calidad de tejido macerado obtenido. Además se comparó el efecto que tiene el uso de la enzima cruda proveniente de un medio de cultivo con la enzima purificada parcialmente, y de esta manera determinar el efecto que pueden presentar algunos componentes propios del cultivo del hongo sobre la acción de la enzima. Por último, algunas fracciones obtenidas durante el proceso fueron caracterizadas por medio de medidas de diferentes carbohidratos y de naringina. Particularmente, esto último permitirá comprobar si la maceración enzimática posibilita la conservación de compuestos de interés dentro de la célula. Se utilizó una solución stock de PPasa-SE proveniente de un medio de cultivo crudo, cuya actividad enzimática y concentración de proteína fue de 3.500 U/ml y 5,1 mg/ml, respectivamente. El proceso de maceración se llevó a cabo usando 2 g de albedo de pomelo cortado en cilindros (Ø: 4 mm y 5 mm de longitud), al cual se agregaron 10 ml de buffer citrato, para luego agitar en un sistema reciprocante a una velocidad de 200 golpes/min durante 1 h. Posteriormente se agregaron 5 ml de la misma solución buffer con una actividad enzimática de 50 U/ml, y se continuó la agitación por 3 h, manteniendo la temperatura de trabajo. Después de ese tiempo se separó por filtración el tejido no macerado (TNM), y el filtrado fue centrifugado (3.000 rpm, 10 min), obteniendo así las fracciones de tejido macerado (TM) correspondiente al precipitado y la fracción de sobrenadante (S), la cual se compone mayoritariamente de los carbohidratos que forman la lamina media del tejido vegetal, principalmente pectina. Todas las fracciones obtenidas fueron cuantificadas con base en el peso seco. Se utilizó el diseño experimental de Doehlert para encontrar las condiciones de operación que permitieran un máximo nivel de TM, trabajando en los siguientes intervalos de operación: temperatura entre 30 y 44ºC, concentración de buffer citrato entre 5 y 40 mM, pH entre 3,0 y 6,0 y fuerza iónica entre 0,15 y 0,25 mS. La calidad del tejido macerado fue observada mediante microscopía. La concentración de sacarosa, fructosa y naringina en las fracciones TM y S fue determinada por HPLC. La concentración de pectina fue medida por técnica espectrofotométrica. Por último se utilizó la PPasa-SE purificada parcialmente por medio de cromatografía de membrana, para comparar los resultados obtenidos con la solución stock proveniente del medio de cultivo crudo. Se encontró un polinomio que representa adecuadamente el proceso de maceración en función de temperatura, concentración de buffer y pH con un R2 de 0.86. Este modelo permitió definir como condiciones óptimas de operación; temperatura 30ºC, altas concentraciones de buffer y pHs cercanos a 5,0, para las cuales se obtuvo un 42% de TM. No obstante se observó que el factor pH no tiene un efecto muy significativo cuando se usan altas concentraciones de buffer, lo cual permite operar a pH bajos, evitando así posibles contaminaciones microbianas, sin un detrimento importante en el rendimiento del proceso. Adicionalmente, se encontró que altos niveles de fuerza iónica disminuyen notoriamente el rendimiento de TM, lo cual puede ser explicado por un efecto hipotónico de la solución sobre la célula, que hace que la misma estalle dando como resultado una menor fracción de tejido macerado y una mayor fracción en el sobrenadante. Lo anterior fue comprobado mediante observaciones microscópicas. Al comparar la acción de la enzima proveniente del medio de cultivo crudo con la enzima purificada parcialmente no se encontró una diferencia significativa ni en la cantidad de tejido macerado ni en la calidad del mismo. Se encontró que la fracción de S contiene una concentración de pectina, sacarosa y fructosa de 3,35, 6,3 y 2,15 g/l respectivamente. Las fracciones de TM y S presentaron una composición de naringina de 4,84 y 0,87 g/l, respectivamente. Se concluye que con la enzima proveniente del medio de cultivo crudo, a temperatura de 30ºC, concentración de buffer citrato 45 mM, pH: 3,5 y baja fuerza iónica, se obtienen altos rendimientos de tejido macerado, el cual presenta un alto nivel de células independientes e intactas, conservando de esta manera los nutrientes propios del tejido.