Diferenciación cardíaca a partir de células madre embrionaria humanas: optimización el protocolo clásico

CAROLINA BLUGUERMANN; LEONARDO ROMORINI; GUILLERMO VIDELA RICHARDSON; MARÍA QUESTA; DARÍO FERNÁNDEZ ESPINOSA; MARÍA ELIDA SCASSA; DENIS EVSEENKO; SANTIAGO G. MIRIUKA

Mar del Plata

Congreso; LVII congreso de SAIC; 2012

Sociedad Argentina de Investigación Clinica

La metodología más usada para obtener cardiomiocitos a partir de hESCs, comprende la formación de agregados celulares tridimensionales (cuerpos embrioides, CEs) a partir de colonias de hESCs y el posterior aislamiento de las zonas contráctiles que se desarrollan en los mismos. Dicho metodo de diferenciacion se basa en el uso de suero fetal bovino, el cual contiene diversos factores que inducen la diferenciación de las células a los tres tejidos embrionarios, ectodermo, mesodermo y endodermo. Con el fin de optimizar el protocolo de diferenciación cardiaca, decidimos implementar un protocolo que incluya un medio de composición definida; mediante el agregado de factores específicos que dirijan la diferenciación hacia tejido mesodérmico en primera instancia y a mesodermo cardiaco en un segundo paso. Este protocolo se basa en el agregado de moléculas específicas en ventanas temporales acotadas. Las moléculas cardioinductivas utilizadas son: Proteína morfogenéticas de hueso 4 (BMP4) y Activina A como inductores de progenitores de la línea primitiva y del mesodermo; el compuesto IWR-1 como inhibidor de la vía canónica de Wnt, que permite la especificación del mesodermo cardíaco y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que promueve la expansión y maduración de dicha población.Resultados: Al comparar el número de áreas contráctiles obtenidas en este protocolo versus el método clásico de diferenciación pudimos comprobar que el nuevo protocolo denominado de Spin Ces, es más eficiente en la generación de las mismas. Las células obtenidas por el mismo fueron caracerizadas mediante: 1)Citometría de flujo: 50 % de las c;elulas en areas contractiles fueron MF-20+ y el 30% cTnT+. 2) Inmunohistoquimica: detectamos areas positivas para MF-20 y cTnT en cortes histologicos de Ces completos. 3) RT PCR de tiempo real: Observamos el aumento en la expresion de los mRNA codificantes para MF-20, cTnT, TBX5, GATA4 y NKX 2.5. Conclusiones: El protocolo de Spin CEs resultó más eficiente en la generación de CEs que presentan áreas contráctiles. La presencia de moléculas cardioinductivas incrementa la población de células cardíacas derivadas de hESCs.