Relevancia de la vía de señalización de AKT sobre la supervivencia de células madre embrionarias humanas

LEONARDO ROMORINI; DARÍO FERNÁNDEZ ESPINOSA; CAROLINA BLUGUERMANN; GUILLERMO VIDELA RICHARDSON; MARÍA QUESTA; GUSTAVO SEVLEVER; ALEJANDRA S. GUBERMAN; SANTIAGO G. MIRIUKA

Mar del Plata

Congreso; SAIC; 2011

SAIC

Las células madre embrionarias humanas (CMEh) presentan gran capacidad para diferenciarse in vitro y un enorme potencial para ser usadas como fuente celular en medicina regenerativa. El factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) es fundamental para la supervivencia y el mantenimiento de la pluripotencia y auto-renovación de CMEh. bFGF activa la vía de PI3K/AKT en CMEh, por ende el objetivo de este trabajo es estudiar la relevancia y mecanismos moleculares involucrados en la supervivencia celular mediada por AKT en CMEh. Para ello, se cultivaron las líneas de CMEh WA01 (H1) y WA09 (H9) en presencia de bFGF hasta confluencia, y luego su naturaleza pluripotente fue validada mediante inmunofluorescencia y RT-PCR de los marcadores: TRA1-60, TRA1-81, SSEA-4, Oct-4 y Nanog. La viabilidad celular, medida con el ensayo de XTT, disminuyó de manera concentración dependiente luego del tratamiento durante 24 h tanto con los inhibidores de la PI3K, LY294002 y wortmanina, como con inhibidores que actúan río abajo como el inhibidor IV de AKT (específico de una quinasa que activa a AKT), el inhibidor VIII de AKT (impide la unión de AKT a membrana) y GSK690693 (bloquea el sitio de unión del ATP a AKT) (LY294002 10µM: 57±3,8% y 56,6±7%; wortmanina 100nM: 38,6±3,3% y 42,5±7,2%; I. IV 1µM: 64,9±6,8% y 82,2±7,6%; I.VIII 10µM: 57,4±4,4% y 47,1±4%; GSK690693 1µM: 51,2±3% y 51,8±5%, vs. vehículo para H9 y H1 respectivamente). Por otro lado, se observó un aumento en la fragmentación del ADN (cuantificado mediante ensayo fotométrico de ELISA) en H9 y H1, al inhibir AKT durante 8h (1,8 y 1,4 veces de inducción vs. vehículo I. IV 1µM; 3,3 y 2,7 I. VIII 10µM; 2 y 1,9 GSK690693 1µM). Por último se observó la activación de caspasa-3 y el clivaje de PARP (ambos medidos por Western Blot) a partir de 4h de tratamiento con los inhibidores mencionados. Finalmente, podemos concluir que la señalización mediada por AKT es anti-apoptótica y por ende relevante en la supervivencia celular de CMEh.