Estudio de la virulencia de mutantes de Candida glabrata defectivos en genes FKS utilizando el invertebrado Galleria mellonella como modelo de infecci¨®n.

DUDIUK, CATIANA; MELLADO, EMILIA; LEONARDELLI, FLORENCIA; MACEDO, DAIANA; CABEZA, MATIAS; GAMARRA, SOLEDAD; GARCIA, GUILLERMO

C¨®rdoba

Congreso; Infocus 2015; 2015

Introducci¨®n Candida glabrata es el segundo agente causal de candidemias a nivel mundial, siendo solo superada por C. albicans. En Argentina, ocupa el tercer lugar. El tratamiento de las infecciones por C. glabrata es dif¨ªcil ya que presenta sensibilidad reducida a Anfotericina B y tiene la capacidad de adquirir resistencias secundarias a los triazoles con gran facilidad. Por este motivo, las equinocandinas son consideradas como la primera opci¨®n para el tratamiento de candidiasis invasoras. Estas drogas act¨²an inhibiendo las subunidades Fksp (codificadas por los genes FSK1, FKS2 y FKS3) del complejo enzim¨¢tico 1,3-¦Â-D Glucan sintasa responsable de la s¨ªntesis del componente principal de la pared celular f¨²ngica, los 1,3-¦Â-D glucanos. La resistencia cl¨ªnica de C. glabrata a las equinocandinas ha sido relacionada con mutaciones en FKS1 y FKS2, pero la participaci¨®n individual de cada uno de los genes FKS en la virulencia de esta levadura a¨²n no ha sido estudiada. Recientemente, se han desarrollado modelos alternativos de infecci¨®n f¨²ngica utilizando invertebrados, como Galleria mellonella, que presentan resultados comparables a los modelos mam¨ªferos (por ej. ratones). Estos modelos facilitan el estudio de factores de virulencia f¨²ngicos evitando las consideraciones ¨¦ticas asociadas a los modelos experimentales en mam¨ªferos. Objetivo: Evaluar la virulencia de mutantes de C. glabrata defectivos en los genes FKS utilizando el invertebrado G. mellonella como modelo de infecci¨®n. Materiales y M¨¦todos Se generaron los vectores de disrupci¨®n de los genes FKS1, FKS2 y FKS3, utilizando el gen URA3 como casete de selecci¨®n y utilizando tres t¨¦cnicas distintas: PRODIGE, PCR de fusi¨®n y con enzimas de restricci¨®n, respectivamente. La transformaci¨®n de las levaduras se realiz¨® por la t¨¦cnica de Acetato de Litio utilizando como cepa parental C. glabrata LMDM331 (ATCC 90030 ¦¤URA3). La virulencia de C. glabrata se estandariz¨® en lotes de G. mellonella utilizando diferentes dosis de in¨®culo. Una vez elegido el in¨®culo adecuado, (5X106 UFC/larva) se evalu¨® la virulencia de 5 cepas de C. glabrata, (salvajes y mutantes): ATCC90030, LMDM331, LMDM331∆FKS1, LMDM331∆FKS2 y LMDM331∆FKS3. Los resultados fueron analizados con el m¨¦todo de Kaplan-Meier (curva de muerte) utilizando el software Graph Prism 5.0. Resultado Se obtuvieron C. glabrata defectivas en los genes FKS1, FKS2 y FKS3. Todas las cepas (menos la cepa parental 331), fueron capaces de matar las larvas en un per¨ªodo menor a 5 d¨ªas. No se observ¨® diferencia significativa (p>0.05) entre los mutantes defectivos en los genes FKS y la cepa salvaje (ATCC90030). Conclusi¨®n La deficiencia individual de cada uno de los genes FKS no afectan la capacidad de C. glabrata para infectar a G. mellonella. Sin embargo, el m¨¦todo utilizado no permite establecer diferencias de virulencia sutiles. Se deber¨¢n realizar estudios de competitividad (fitness cost) con los mutantes y la cepa salvaje en este mismo modelo. Palabras