Producción de antígenos recombinantes para el diagnóstico serológico de histoplasmosis

CABEZA, MATIAS; MACEDO, DAIANA; IBARRA-CAMOU, BELEN; DUDIUK, CATIANA; LEONARDELLI, FLORENCIA; SUAREZ-ALVAREZ, ROBERTO; CANTEROS, CRISTINA; GARCIA, GUILLERMO

Congreso; Infocus 2015; 2015

Introducción La histoplasmosis es una infección fúngica sistémica que se adquiere por la inhalación de los conidios del hongo dimórfico Histoplasma capsulatum (Hc). El gold standard para el diagnóstico de histoplasmosis es la detección de Hc en cultivo. Este método requiere de hasta 45 días para observar el desarrollo del hongo, tiene poca sensibilidad y es peligroso ya que Hc es un patógeno clase 3. El método de diagnóstico indirecto que busca anticuerpos anti-histoplasmina por inmunodifusión es específico, de fácil realización e interpretación; por lo que es muy difundido mundialmente y utilizado por el 33% de los laboratorios de la Red Nacional de Laboratorios de Micología de Argentina. La histoplasmina es un antígeno crudo y se obtiene de manera artesanal, lo que hace que sea difícil de estandarizar y de producir en grandes volúmenes, además, de suponer un riesgo biológico importante por el manejo de cultivos vivos durante la producción. Objetivo Producir antígenos de Hc (derivados de los antígenos H y M) empleando la tecnología del ADN recombinante evitándose así emplear cultivos fúngicos vivos. Materiales y métodos Se construyeron modelos estructurales para las proteínas M y H utilizando modelado por homología. La información estructural generada se utilizó para definir las zonas más antigénicas. Las secuencias de interés se amplificaron por PCR utilizando ADN genómico como molde. Las secuencias nucleotídicas se ligaron primero en un vector para conservación y secuenciación (pGEM-T Easy) y posteriormente en un vector de expresión inducible, que genera una fusión a la MBP de Escherichia coli y a una etiqueta de hexahistidinas. Luego, se indujo la expresión y se obtuvieron los extractos crudos por sonicado. De estos, se purificaron las proteínas de interés por cromatografía de afinidad a metal inmovilizado (IMAC). Finalmente se evaluó la antigenicidad de las proteínas mediante Dot Blot, utilizando un suero anti-histoplasmina obtenido en conejo. Resultados Los modelos estructurales construidos permitieron definir las porciones de interés para el antígeno M (CterM) y para el antígeno H (CterH). Se logró amplificar por PCR dichas secuencias y en el caso de CterH, se eliminó un intrón presente en la región codificante, utilizando la técnica de PCR de fusión. La identidad de los clones obtenidos fue verificada por secuenciación. Se obtuvo una buena expresión de ambas proteínas en E. coli y se las logró purificar en un solo paso mediante IMAC. Tanto CterM como CterH resultaron mejores antígenos que la histoplasmina al ser evaluadas por la técnica de Dot Blot. Conclusión Se logró obtener dos antígenos recombinantes de Hc. El método de obtención es simple y evita la utilización de organismos patógenos. En estudios posteriores, mediante el desarrollo de un ensayo de ELISA, se evaluará si tanto CterH como CterM son útiles para el diagnóstico de la histoplasmosis.