La resistencia intrínseca de A. fumigatus a fluconazol se relaciona con el polimorfismo natural Thr301Ile presente en Cyp51Ap.

LEONARDELLI, FLORENCIA; MACEDO, DAIANA; DUDIUK, CATIANA; CABEZA, MATIAS; GAMARRA, SOLEDAD; GARCIA, GUILLERMO

Congreso; Infocus 2015; 2015

Introducción Los hongos del género Aspergillus son resistentes naturales a fluconazol (FCZ). En cambio, la mayoría de las levaduras del género Candida son sensibles a este antifúngico. El mecanismo molecular involucrado en esta diferencia de sensibilidad es desconocido. La enzima diana de los azoles es la 14α-esterol-demetilasa, codificada por los genes ERG11 en Candida spp. y por los genes homólogos CYP51A y CYP51B en Aspergillus spp. En A. fumigatus, sólo CYP51A ha sido relacionado con la resistencia a los azoles. En el Erg11p de C. albicans, las sustituciones Tyr132, Thr315, Ser405, Gly464 y Arg467 son las más comúnmente implicadas en la resistencia secundaria a FCZ. En el Cyp51Ap de A. fumigatus, estos aminoácidos están conservados con excepción del ubicado en la posición equivalente a Thr315 (Ile301). En C. albicans, la sustitución Thr315Ala reduce la actividad inhibitoria de FCZ de 4 a 5 veces. La Thr315 es un aminoácido polar que interviene en la interacción enzima-droga. En contraste, Ala e Ile son apolares. Nuestra hipótesis es que la resistencia intrínseca de A. fumigatus al FCZ se relaciona estrictamente con el polimorfismo natural Ile301 presente en Cyp51Ap. Objetivos Generar un A. fumigatus con un Cyp51Ap que presente el cambio Ile301Thr, y evaluar su sensibilidad a distintos azoles. Materiales y Métodos Se construyó un vector de reemplazo génico clonando en un vector pGEM-T Easy el gen cyp51A de A. fumigatus con la mutación T973C (que produce el cambio de aa. Ile301Thr), seguido del casete hph que confiere resistencia a higromicina B. Para esto se generó el gen mutante, amplificando el CYP51A a partir del DNA de la cepa de A. fumigatus Ku80Δ mediante la técnica de PCR convencional, incluyendo 1Kb de la región 5´UTR e introduciendo la mutación T973C (Ile301Thr) por PCR de fusión. Por otro lado se amplificó el casete de resistencia a higromicina B a partir del plásmido PAN 7.1 y se fusionó a un fragmento de 1Kb de la región 3?UTR del CYP51A. Ambas construcciones se ligaron y clonaron en un único plásmido (LMDM-P87). Se transformó la cepa A. fumigatus Ku80Δ con el vector LMDM-P87, utilizando la técnica de electroporación. Se seleccionaron los organismos transformados con higromicina B. Se evaluó la inserción del casete en el genoma por PCR y se secuenció el gen cyp51A introducido para confirmar la mutación. Finalmente se evaluó la sensibilidad a FCZ mediante el método de microdilución en placa (Documento M38A2 de CLSI) y el método de difusión en agar para las cepas A. fumigatus Ku80Δ y los transformantes. Resultados Se generó un mutante de A. fumigatus con la mutación T973C en cyp51A que produce el cambio de aminoácido Ile301Thr en Cyp51Ap. La CIM de este mutante disminuyó 5 veces respecto de la cepa salvaje, siendo 20 µg/mL y 640 µg/mL, respectivamente. Conclusión Se confirmó la hipótesis, encontrándose que el cambio Ile301Thr indujo la reducción de la CIM del mutante cinco diluciones. Por lo tanto, la resistencia intrínseca de A. fumigatus a fluconazol se debería sólo a este polimorfismo natural.