Susceptibilidad de distintas especies de insectos plaga a la proteína cry1Ia de Bacillus thuringiensis INTA H4-3

PEDARROS, A.; BERRETTA, M.; ONCO, M.; PÉREZ, M.; SAUKA, D.; BENINTENDE, G.

Buenos Aires

Congreso; III Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2015

Asociación Argentina de Microbiología

Bacillusthuringiensis es un bacilo gram positivo que produce durantela esporulación, una inclusión parasporal formada por proteínas denominadas Cryque pueden ser tóxicas para distintas especies de insectos. En particular, lasproteínas de la clase Cry1I se caracterizan porque permanecen solubles y sonsecretadas al medio por la bacteria en la fase temprana de esporulación. Ademásse han descrito por presentar actividad tóxica dual para larvas de insectoscoleópteros y lepidópteros. En este trabajo se evaluó la toxicidad de Cry1Iaexpresada en forma heteróloga para distintas especies de insectos plaga. El gencry1Ia se amplificó a partir de lacepa nativa de B. thuringiensis INTAH4-3, con primers específicos y seclonó en el vector plasmídico pET30 (Novagen) que dirige la expresión induciblede la proteína en la cepa de Escherichiacoli BL21(DE3). Se expresaron 3 variantes de Cry1Ia, dos de ellascorrespondientes a la proteína completa fusionada a una secuencia depolihistidina en posiciones alternativas, y otra que constituye una versióntruncada de la proteína, pero conteniendo el fragmento activo. Se evaluó latoxicidad de las mismas en dos especies de coleópteros, Anthonomus grandis y Alphitobiusdiaperinus, y en tres especies de lepidópteros, Spodoptera frugiperda, Rachiplusianu y Cydia pomonella. Cadaproteína se suministró a las larvas de primer estadio de los insectosevaluados, por incorporación en la dieta de cantidades definidas de células delcultivo inducido de E. coli. En todoslos casos se usó una concentración de proteína equivalente a 175 µg/ml. Losensayos se realizaron en 2 placas de 24 pocillos conteniendo la dieta formuladapara cada especie a cada uno de los cuales se transfirió una larva; las placasse incubaron a 28 ºC. La mortalidad se registró a los 7 días en el caso loscoleópteros y a los 5 días para los lepidópteros. Los ensayos se realizaron portriplicado. Las variantes de Cry1Ia no presentaron toxicidad contra A. grandis, A. diaperinus y S. frugiperda.Para estas especies, la mortalidad no difirió de la de los controles tratadoscon células de E. coli transformadas con el vector vacío, con valores de hasta10%. En el caso de C. pomonella seobtuvieron valores de mortalidad de 85% a 100%, dependiendo de la proteínautilizada, y para R. nu de 40% a 70%.En este último insecto también se observó un severo retraso en el desarrollo delas larvas sobrevivientes. La eliminación de una porción C-terminal de Cry1Ia,ausente en toxinas maduras relacionadas, no resultó en toxicidad contra losinsectos no susceptibles. Por otra parte, las tres variantes de Cry1Iaexpresadas manifestaron diferencias de toxicidad contra las especiessusceptibles. La proteína de fusión con polihistidina en posición C-terminalresultó más tóxica. La proteína con dicha modificación, introducida parafacilitar su purificación, será utilizada para cuantificar su efecto tóxico pordeterminación de CL50.