Determinacion del antioxidante trans resveratrol empleando biosensores basados en peroxidasas

A. M. GRANERO; H. FERNÁNDEZ; M. A. ZÓN

Villa de Merlo, San Luis, Argentina

Congreso; III Congreso Argentino de Química Analítica; 2005

Area de Química Analítica, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, UNSL

El antioxidante trans 3,5,4´-trihidroxi estilbeno ó trans resveratrol (t-Res) es una fitoalexina sintetizada por diversas plantas. Estimula la resistencia a la infección fúngica y se encuentra en una gran concentración en una variedad de uvas llamada vitis vinifera, la cual lo sintetiza en respuesta a la infección producida por el hongo Botrytis cinerea. Se ha propuesto que el t-Res confiere protección contra la artereoesclerosis y las enfermedades cardíacas coronarias.             La determinación analítica de este antioxidante se ha realizado en los últimos años empleando las técnicas cromatográficas, particularmente, la cromatografía HPLC.             En este trabajo se propone el empleo de un biosensor amperométrico basado en la enzima peroxidasa para la determinación del t-Res. Este método emplea un electrodo de pasta de carbón, el cual se rellena con una mezcla homogenizada de la enzima peroxidasa, ferroceno (Fc) y pasta de carbón en una relación 1:1:10, respectivamente. Como enzima peroxidasa se emplea tanto la peroxidasa de rábano comercial como una isoenzima básica (catiónica) de peroxidasa extraída y purificada en nuestro laboratorio a partir de nabos obtenidos en comercios locales. La superficie del electrodo se cubre con una membrana de diálisis (“peso molecular de corte 100”), la cual cumple la doble función de minimizar el ruido eléctrico y de evitar la pasivación de la superficie del electrodo como consecuencia de los productos poliméricos que se generan habitualmente durante la oxidación de los compuestos fenólicos. Las medidas amperométricas se realizan a un potencial, E = + 0,050 V vs ECS, potencial al cual el ión ferrocinio (Fc+), generado durante el ciclo catalítico de la enzima peroxidasa, es reducido a Fc (actuando como mediador redox), siendo la corriente de reducción proporcional a la concentración del compuesto fenólico en solución. Como medio de reacción se emplea una solución reguladora de fosfato de pH = 7.             Además, considerando que el H2O2 participa en la primera etapa del ciclo peroxidativo de la enzima, el funcionamiento del electrodo modificado que se emplea en este trabajo se estudió, en una primera etapa, adicionando al medio de reacción solamente distintas alícuotas de H2O2, encontrándose en este caso que la corriente de reducción del ión Fc+ es proporcional a la concentración de H2O2 en el seno de la solución.             Como electrodos de trabajo se emplean electrodos de pasta de carbón de 3 mm y de 1,6 mm de diámetro interno, respectivamente. Se comparan y discuten los resultados experimentales obtenidos con ambos electrodos.             Los parámetros cinéticos de la reacción enzimática, tales como la constante de Michaelis Menten (KM) y la corriente máxima (Imax) se determinan a partir de las corrientes de estado estacionario (Ie) a partir de los gráficos de Lineweaver-Burk, en una primera instancia y, luego, a partir del ajuste de las curvas Ie en función de la concentración analítica del sustrato (H2O2 ó t-Res) empleando un procedimiento de ajuste de cuadrados mínimos no-lineales.             En esta primera etapa, se emplea como sustrato el t-Res comercial. En el futuro, esta metodología se aplicará a la determinación del antioxidante en matrices naturales que lo contengan.