Amplificación isotérmica de ácidos nucleícos, LAMP, para la detección de Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, como nueva técnica diagnostica.

MOYANO, R.; PERALTA, L.; ALVARADO PINEDO, F.; TRAVERIA, G.; ROMANO, M.

Buenos Aires

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología y II Congreso Microbiología Agrícola y Ambiental 2013; 2013

AAM (Asociacion argentina de microbiologia)

Introducción: La paratuberculosis (PTB) es una enteritis crónica que afecta a los rumiantes, la cual causa importantes pérdidas económicas. Además, la enfermedad preocupa por la posible vinculación del agente etiológico, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) en el proceso inflamatorio del intestino humano conocido como enfermedad de Crohn. Para la detección temprano de PTB es importante desarrollar y mejorar los métodos de diagnóstico. Recientemente se introdujo en el diagnóstico de varias enfermedades, una técnica llamada LAMP, que es una amplificación isotérmica. Solo una publicación hace referencia a la aplicación de LAMP para detectar MAP (Enosawa, 2003). LAMP utiliza múltiples iniciadores y condiciones isotérmicas (60-65 °C) para la amplificación de la secuencia blanco, no requiere termociclador para garantizar los ciclos. El proceso es altamente específico y de una sensibilidad comparable al de la PCR. La observación del producto de amplificación puede hacerse visualmente por turbidez o por cambios de color agregando ciertos reactivos (BrEt, Sybr Green). El objetivo de este trabajo fue desarrollar esta técnica para la detección de MAP. Materiales y Métodos: Para realizar esta técnica se comenzó con el diseño de primers on-line (Primersexplorer V3-V4) teniendo como referencia el elemento de inserción de MAP IS900 (GenBank: X16293.1). Una vez diseñado los primers se procedió a realizar la técnica de LAMP, con Sybr Green como colorante, para distintas muestras de ADN extraído de cultivos, tanto de MAP, como de otras micobacterias, y también de muestras de materia fecal, obtenidas de animales con PTB. Los productos amplificados fueron también corridos en un gel de agarosa. Resultados y conclusiones: Pudimos observar que al realizar la reacción de LAMP para PTB con una curva de diluciones de ADN, se observo una resolución en la técnica colorimétrica hasta concentraciones de 0,5 ng de ADN. Y pudimos observar amplificación detectable por electroforesis hasta concentraciones de 0,0025 ng. Al evaluar la reacción para distintas micobacterias, se evaluaron 8 especies diferentes de micobacterias, sin obtener resultados positivos que crucen con la reacción específica con MAP. Dando una especificidad del 100%. Al evaluar la reacción en muestras de ADN provenientes de materia fecal de animales con PTB, se realizaron 15 extracciones de distintos animales de las cuales resultaron positivas 9. Por lo cual se puede concluir que LAMP es una técnica sensible y específica para detectar animales con PTB, y permite la discriminación visual de resultados sin equipos especializados. LAMP es aplicable en las condiciones de campo, tiene bajo costo y facilidad de aplicación, ya que puede utilizarse sobre muestra de materia fecal. En los casos de bajas concentración de ADN es aconsejable sembrar en geles de agarosas el producto de amplificación, dado que la observación de la turbidez es menos sensible que la visualización de los productos en dichos geles.