Evaluación del protocolo de PCR-Secuenciación del gen Cacophony IVS6 y suaplicabilidad en la identificación de Phlebotominae

MOYA SL; GIULIANI MG; MANTECA ACOSTA M; SALOMON OD; LIOTTA DJ

Posadas

Exposici�n; IX CONGRESO ARGENTINO DE ENTOMOLOGIA; 2015

Sociedad Argentina de Entomología (SEA), Centro de Investigaciones Entomológicas (CIE-PTMi), Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales (FCEQyN-UNaM)

La familia Phlebotominae (Díptera: Psychodidae) está representada en Argentina por aproximadamente 40 especies, de las cuales 4 son consideradas vectores o sospechadas de estar involucradas en la transmisión de especies de Leishmania spp, agente causal de la Leishmaniasis. Dado que la propagación de la enfermedad está determinada principalmente por la presencia/ausencia de especies vectoriales, su caracterización mediante técnicas moleculares, contribuiría en al control de la misma. La clasificación taxonómica de los flebótomos se basa en caracteres morfológicos del adulto, procedimiento acomplejado por la existencia de especies crípticas, variabilidad intraespecífica y el tratamiento químico al que se somete al espécimen para su observación microscópica, que inhibe su posterior análisis mediante técnicas moleculares. El objetivo de este trabajo ha sido evaluar el poder de discriminación a nivel de especie del protocolo de PCR-Secuenciación con blanco en el gen cacophony (región-IVS6) y su aplicabilidad como método alternativo a la clasificación taxonómica, contribuyendo así a la vigilancia de vectores de Leishmania spp.Se analizaron 107 flebótomos clasificados a nivel de especie mediante observación de espermatecas según clave Young & Duncan con modificaciones de Andrade Filho et al. (2003). El ADN fue extraído y cuantificado mediante kit comercial. Se amplificó la región-IVS6 del gen cacophony según el protocolo de PCR descripto por Lins et al. (2002), y los productos se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% a 5V/cm. Las secuencias de estos productos se evaluaron según pureza y señal de los picos de fluorescencia en los cromatogramas para el posterior análisis de identidad mediante la herramienta Basic Local Alignment Search Tool (BLASTm). En el análisis filogenético se incluyeron 7 secuencias obtenidas de GenBank, realizándose un alineamiento múltiple para la construcción de árboles de distancia utilizando el algoritmo Neighbor Joining (NJ) con el programa MEGA6 según Tamura et al. (2007). El soporte estadístico del árbol se evaluó mediante un test de Bootstrap de 1000 réplicas.Debido a que GenBank sólo posee cuatro secuencias de la totalidad de especies estudiadas, la herramienta BLASTm no resultó útil para evaluar la identidad de las mismas. Sin embargo, mediante el alineamiento múltiple realizado con 107 secuencias, se evidenció el polimorfismo presente en la región cac-IVS6. En el árbol filogenético construido, se observó que las secuencias pertenecientes a diferentes géneros se agrupan en clusters separados, demostrando así que el polimorfismo presente en la región IVS6 del gen cacophony es suficiente para diferenciarlos, concordando con los resultados obtenidos por Lins et al (2002).El poder de discriminación de Phlebotominae obtenido mediante protocolo de PCR-secuenciación del gen cacophony-IVS6, resultó similar al logrado por el método de determinación por observación de espermateca; además, la información generada por el primero ha sido mayor permitiendo la correcta identificación de cuatro ejemplares cuya determinación morfológica fue incierta. A pesar de lo promisorio de los resultados, dos secuencias no se agruparon de la forma esperada, por lo que se propone un rediseño de cebadores de PCR al efecto de generar una secuencia de mayor longitud que aumente la capacidad de resolución del protocolo. De la misma manera, la pertinencia de la metodología debe evaluarse en función de los objetivos y las especies presentes en el área de estudio.