Presencia de AGP/extensinas, arabinogalactanos sulfatados y ƒÒ-(1„_4)-mananos en la pared celular del alga verde Codium¡¨,

ESTEVEZ J.M., M. CIANCIA , L. KASULIN, A. DE DIOS Y A. S. CEREZO

Chascomús, Buenos Aires

Congreso; XXVI Reunión de la Asociación Argentina de Fisiología Vegetal; 2006

Asociación Argentina de Fisiología Vegetal, ,

La expresión de genes codificantes de pépticos ricos en hidroxiprolina con la secuencia repetitiva (Ser-Pro) unidos por el extremo N-terminal a la secuencia señal de tipo extensina y a un tag de tetra-cisteinas (Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys) se siguió en forma transiente en tabaco y transiente/estable en Arabidopsis bajo el control del promotor constitutivo 35S. La técnica de localización se basó en la interacción entre el reactivo FIAsHs-EDT2 (derivado biarsénico no fluorescente) con el tag de tetracisteinas Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys. Tanto los reactivos FIAsH-EDT2 como ReAsH-EDT2, derivado de fluorocromo resorufin (Fig. 1A), se unen con gran afinidad y especificidad a la secuencia TC formando el complejo TC-(Re)FIAsH, el cual es fluorescente. Esta unión esta basada en los cuatro enlaces covalentes entre los dos grupos arsénico con los grupos tioles del tag TC. Esta técnica acoplada a la microscopía confocal posibilitó: (i) localizar in vivo los pépticos con secuencias de tipo AGP (arabinogalactanos asociados a proteínas) con el reactivo FIAsH- o con ReAsH-EDT2 obteniéndose patrones similares de expresión; (ii) seguir la dinámica de la biosíntesis de estos pépticos en el rango de horas, primero marcados con FIAsH-EDT2 y luego con Reas-EDT2; (iii) co-localizar la expresión de los oligopeptidos ricos en hidroxiprolina utilizando el reactivo ReAsH-EDT2 y la sub-estructura celular de referencia con dos marcadores fusionados a GFP para membrana plasmática (D41) y aparato de Golgi (Dscs). Los resultados obtenidos aquí indican que tanto los reactivos FIAsH-TC como ReAsH-TC pueden ser usados para localizar in vivo (glico)proteínas en células vegetales. FIAsH-TC mostró mejor relación senal/ruido en comparación con ReAsH-TC. Cuando la expresión siguió en células epidérmicas de tabaco no se detectó interferencia en los controles a diferencia de una señal inespecífica pero débil debida a posibles reacciones inespecíficas en algunas células estomáticas y núcleos en Arabidopsis. La mayor ventaja de utilizar este tag de TC para la marcación de proteínas mediante fluorescencia en comparación con las proteínas fluorescentes existentes (GFP, CFP, YFP, etc) son su relativo pequeño tamaño y la habilidad del tag TC de unirse a dos fluoroforos con distintas longitudes de onda de excitación/emision permitiendo diferenciar la biosíntesis de moléculas a lo largo del tiempo. Finalmente, la alta afinidad del FlAsH por secuencias deTC permitiría en teoría su posible uso como tags de afinidad para la purificación de proteínas u otros experimentos.