Estructura cristalográfica de la B-lactamasa PER-2: evidencias del papel de R220 en la interacción con B-lactámicos e inhibidores de B-lactamasas

M. RUGGIERO; E. SAUVAGE; R. HERMAN; F.SAPUNARIC; M. GALLENI; G. GUTKIND; P. CHARLIER; P. POWER

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Jornada; 157º Jornada Científica "Resistencia bacteriana y uso racional de los antibióticos"; 2013

Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica

Introducción:La estructura cristalográfica de PER-1 ha sido resuelta, y la función de distintos residuos de aminoácidos ha sido estudiada. La estructura de esta b-lactamasa revela características  particulares: un plegamiento diferente del  omega-loop y la inserción de cuatro aminoácidos que generan un plegamiento nuevo de la cadena B3, lo cual provoca un bolsillo catalítico más amplio en el cual se pueden acomodar más eficientemente los sustituyentes  voluminosos en R1 de las oximinocefalosporinas como cefotaxima y ceftazidima. A partir de modelados moleculares  teóricos, hemos observado que mutaciones en R220 de PER-2 parecen ser equivalentes a  mutaciones en R244 de las variantes de TEM resistentes a  inhibidores, probablemente influyendo en la susceptibilidad a la inhibición y un cambio en el perfil de hidrólisis de sustratos.Objetivos:En este trabajo hemos determinado la estructura cristalográfica de PER-2, con una  resolución de 2,10Å, y evaluamos el posible rol de la R220 en la estructura y en la actividad frente a los  b-lactámicos y lo inhibidores de b-lactamasas.Métodos:PER-2 fue purificada a homogeneidad por técnicas de cromatografía convencionales. Los cristales fueron obtenidos con el método de la gota colgante a 20°C. La difracción de rayos X fue realizada en el sincrotrón  Soleil (Paris, France) bajo condiciones criogénicas  (100 de los datos colectados fue realizado con XDS, y el escalado de las intensidades con XSCALE. La estructura fue obtenida y refinada por reemplazo molecular, utilizando REFMAC5, TLS y Coot. Los modelos fueron obtenidos con Coot y PyMol. Los parámetros cinéticos fueron determinados en condiciones de estado estacionario, y los parámetros de inhibición por ensayos competitivos.Resultados:La estructura de PER-2 fue refinada a 2,10Å. En PER-2, la cadena B3 está desplazada unos 5 Å hacia el bolsillo catalítico en comparación con otras b-lactamasas de clase A, creando un ambiente aparentemente más favorable para la estabilización de moléculas como las oximino-cefalosporinas a través de puentes de hidrógeno. Esta cadena, además, parece estar estabilizada por puentes de hidrógeno entre T237 y R220. De acuerdo con modelos simulados de la enzima salvaje y de  mutantes en R220, el ambiente de los residuos en la posición 220 parece influir tanto  en la inhibición por inhibidores suicidas como en la actividad catalítica frente a distintos sustratos. Los parámetros cinéticos apoyan este comportamiento, especialmente para algunos sustratos, para los cuales los valores aumentados de  Km se acompañan con una disminución de los valores de  kcat valores de kcat/Km 10 veces menores.Conclusiones:Las evidencias estructurales sugieren que la interacción de las diferentes moléculas de b-lactámicos con la red de puentes de hidrógeno asociados con los residuos del complejo de coordinación de la reacción  está estabilizada por residuos de aminoácidos específicos, siendo R220 un residuo  importante para la actividad frente a cefalosporinas y probablemente los inhibidores suicidas. La estabilidad global de las mutantes R220, acompañada por la modificación en su comportamiento frente a los diferentes  b-lactámicos e inhibidores, sugiere que estas variantes podrían ser seleccionadas durante terapias in vivo con estas drogas.