CLONADO DEL GEN DE LA VP2 DE UNA CEPA 2C DE PARVOVIRUS CANINO EN UN SISTEMA DE EXPRESION EUCARIOTA

MARIANELA BUCCI; CARINA ROMANUTTI; LETICIA KELLER; NORA MATTION; JOSE LA TORRE; MARINA GALLO CALDERON

Buenos Aires

Jornada; V JORNADAS DE JÓVENES INVESTIGADORES Ciencia y Sociedad; 2015

FVET. UBA

CLONADO DEL GEN DE LA VP2 DE UNA CEPA 2C DE PARVOVIRUS CANINO EN UN SISTEMA DE EXPRESION EUCARIOTAMARIANELA BUCCI1;CARINA ROMANUTTI1; LETICIA KELLER2; N. MATTION1; J. LA TORRE1;M. GALLO CALDERON1.(1) Instituto de Ciencia y Tecnología Dr. Cesar Milstein, CONICET.(2) Fundación de Estudios en Virología Animal (FEVAN).Introducción: El Parvovirus Canino es un virus, con un genoma a ADN de cadena simple, altamente contagioso, que provoca miocarditis y gastroenteritis hemorrágicas severas en cachorros, mostrando altas tasas de morbilidad y mortalidad. El genoma codifica para 2 proteínas estructurales, VP1 y VP2 (componente principal de la capside) y 2 proteínas no estructurales. El PVC ha evolucionado; las variantes PVC2a, PVC2b, y PVC2c reemplazaron secuencialmente a la cepa original PVC2. En nuestro país la PVC2c, es la predominante Si bien la vacunación es la manera más práctica, efectiva y económica de prevenir la enfermedad, se han reportado muchos casos de animales que aun estando vacunada, se enferman.Objetivo: Obtener el gen de la VP2 de PVC en un sistema de expresión eucariota.Materiales y Métodos: A partir de un hisopado rectal obtenido de un perro con sintomatología clínica de PVC, se extrajo el ADN y se amplificó por PCR un fragmento del gen de la VP2, obteniéndose un diagnóstico molecular positivo para PVC, y confirmando la presencia de la cepa PVC2c, por secuenciación. Posteriormente, se amplificó por PCR el gen completo de la VP2, se clonó en pGEM®-T Easy Vector y se secuenció. Luego, fue subclonado en el vector pcDNA?HisMaxC, el cual permite la expresión de la proteína fusionada a 6 Histidinas. Se realizaron transfecciones de células Hek 293 (Human Embryonic Kidney 293), mediante 2 métodos diferentes: el de lipofección con Lipofectamina 2000 y el de Cloruro de Calcio. Se analizaron los lisados celulares en un gel de SDS-poliacrilamida al 8%. La detección de la expresión de las proteínas recombinantes se realizó mediante la técnica de Western Blot, utilizando un anticuerpo comercial anti Histidina. Resultados: Los experimentos de Westernblot muestran, en la transfección realizada con lipofectamina, la obtención de una banda de aproximadamente 70 Kda que correspondería a la VP2 de PVC, la cual no está presente en las transfecciones realizadas con el vector vacío.Conclusiones: Se logró expresar la proteína VP2 de PVC, en un sistema de expresión eucariota. Si bien estos resultados son preliminares, permiten pensar la estrategia de eventualmente, desarrollar un inmunógeno actualizado a ADN contra el Parvovirus Canino.