Estandarización de un método para la cuantificación de ácido-indol- 3-acético en formulaciones de Azospirillum brasilense.

CASSAN, FABRICIO; MOLINA, ROMINA; TORRES, DANIELA; OBANDO, MELISSA; RIVERA, DIEGO

Córdoba

Jornada; XV Jornadas Argentinas de Microbiología. Adelantos en el diagnóstico Microbiológico.; 2014

Asociación Argentina de Microbiología (AAM)

El uso de bacterias promotoras de crecimiento [PGPR] se ha convertido en una alternativa biotecnológica para optimizar la producción de cultivos. Actualmente, el análisis funcional de la producción de fitohormonas por PGPR y su regulación en plantas superiores ha resurgido debido a los espectaculares avances en la integración de los modelos de estudios bioquímicos, fisiológicos y moleculares. Es por ello que miembros del género Azospirillum han proporcionado un excelente modelo experimental para investigar y comprender el papel fisiológico y molecular de auxinas sobre el crecimiento de las plantas. Debido a esto, se hace necesario estandarizar un método simple, efectivo y reproducible para la cuantificación de ácido-indol-3-acético en formulaciones de Azospirillum sp. Por esta razón, el objetivo del trabajo fue la validación del procedimiento colorimétrico de cuantificación de auxinas propuesto por Salkowsky en formulaciones de A. brasilense. Para generar la propuesta, se partió de información preliminar, obtenida por nuestro grupo o por otros a nivel mundial: (1) la mayor proporción de auxinas que produce Azospirillum brasilense en presencia de L-triptofano [su precursor natural] son del tipo ácido-indol-3-acético [AIA], siendo las otras extremadamente minoritarias en esta relación. Esto determina que se encuentren casi por debajo del límite de detección del método colorimétrico y en algunos casos de ciertos métodos cromatográficos; (2) la cantidad de AIA producida por este microorganismo se ubica entre 10-50 μg.ml-1 y está dentro del rango de detección del método. Adicionalmente, tiene poca variabilidad entre cepas o especies de este género; (3) existe una fuerte correlación entre los resultados obtenidos por la metodología propuesta, con otras metodologías de mayor complejidad, tales como la cromatografía líquida [HPLC], gaseosa [GC] o aquellas acopladas a espectrometría de masas [MS]. Sobre la base de estas consideraciones hemos validado esta propuesta experimental sobre la base de una innumerable cantidad de muestras experimentales durante más de 5 años de trabajo y sobre la correlación con metodologías de mayor complejidad. Se toman 1000 μl del cultivo bacteriano y se colocan en un tubo plástico del tipo eppendorf de 1,5 ml de capacidad. Se centrifugan a 10.000 rpm por 10 m y opcionalmente se filtran [0.2 μm]. Se toman 500 μl del sobrenadante y se mezclan con 500 μl del reactivo de Salkowsky [7.9 M H2SO4 y 12,5 g/L FeCl3] agitando 10 veces en forma de inversión y suavemente. Se incuban por 30 minutos en completa oscuridad y se mide la absorbancia en un espectrofotómetro a 530 nm. Con los datos de absorbancia se obtiene un promedio de 3 réplicas de la muestra [réplica experimental] y 3 réplicas del tratamiento [réplica biológica] y se hace el cálculo de concentración por el uso de la ecuación obtenida de una curva patrón obtenida con soluciones entre 0.1- 50 mM de AIA puro. La concentración de AIA deberá expresarse en μg.ml-1.