NITROSILACIÓN Y DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL EN EL SNC EN DESARROLLO LUEGO DE UN DAÑO HIPÓXICO

S.GIUSTI; D.CONVERSO; J.J.PODEROSO; S. FISZER DE PLAZAS

Villa Giardino, Córdoba

Taller; Taller Argentino de Neurociencias; 2005

El SNC en desarrollo es especialmente sensible a los daños inducidos por la disminución en la tensión de oxígeno. Las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno, cuya formación puede inducirse por eventos de hipoxia/reoxigenación, intervienen en procesos de amplificación del daño modulando la expresión y/o actividad de enzimas, y produciendo daños oxidativos en macromoléculas. En algunos modelos de hipoxia en animales adultos e hipoxia/isquemia en neonatos se ha descripto un aumento en la producción de óxido nítrico (NO). EL NO estimula la producción mitocondrial de especies reactivas del oxígeno (ROS), fundamentalmente de anión superóxido (O2-) , peróxido de hidrógeno (H2O2), y peroxinitrito (ONOO-). Este trabajo tiene como objetivos determinar si los eventos de hipoxia/reoxigenación durante el desarrollo embrionario inducen una modulación en la principal enzima productora de NO en el SNC, la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS), caracterizar la cinética temporal de esa modulación y su compartimentalización citosólico/mitocondrial y correlacionar la modulación de la expresión de nNOS con indicadores de la función mitocondrial y con el estado de nitrosilación proteica. El modelo experimental es el lóbulo óptico de embriones de pollo en el día embrionario 12  sometidos a una hipoxia aguda prenatal (8% [O2], 60 min.) seguida  de distintos tiempos de reoxigenación: 1hs., 2hs., 3hs., y 4hs. En los distintos tratamientos se cuantificó la expresión de nNOS en fracciones citosólicas y mitocondriales mediante la técnica de Western blot. Como indicadores de la función mitocondrial se midieron los cambios en la actividad de los complejos respiratorios I y IV. La actividad del complejo I fue determinada por monitoreo de la oxidación del NADH a 340 nm y la del complejo IV por monitoreo de la oxidación del citocromo c a 550 nm. Se determinó la expresión de los complejos y el estado de nitrosilación proteica por Western blot. Los resultados obtenidos muestran que existe un aumento transitorio en la expresión de nNOS. En la fracción citosólica el aumento máximo es del 50% (P<0.05)y ocurre durante la hipoxia y la primera hora de reoxigenación, en tanto que en la fracción mitocondrial es de casi 400% (P<0.01) y ocurre durante la primer y segunda hora de reoxigenación en la fracción mitocondrial. En ambos se observan valores normales en los tiempos posteriores. Además, se detectó una disminución significativa (P<0.01) de la actividad del complejo I a partir de la primer hora de reoxigenación, sin detectar disminuciones en la expresión de este complejo. Por último, en el análisis de nitrosilación de proteínas se evidencia un aumento en la proporción de proteínas citosólicas nitrosiladas durante la hipoxia y la primera hora de reoxigenación. En conclusión, los resultados muestran que los eventos de hipoxia/reoxigenación inducen un aumento transitorio en la expresión de nNOS en citosol y mitocondrias y que la actividad del complejo I se encuentra reducida a partir de la primera hora de reoxigenación. Esta disminución en la actividad no se debería a una disminución de la expresión del complejo. Los datos sugieren que la reducción en la actividad del complejo I, y por ende de la reducción de la función mitocondrial,  podría deberse a una inhibición de este complejo por el peroxinitrito. Este último es un agente nitrosilador de proteínas, y se encontraría en mayores concentraciones gracias al aumento en la expresión de nNOS.