Validación de un método para determinar malondialdehído en semen bovino criopreservado por cromatografía líquida de alta presión.

YONNY, M. E.; REINERI, P.; PALMA, G.; NAZARENO, M.A.

Mendoza

Congreso; 7 Congreso Argentino de Química Analítica; 2013

AAQA

En el ganado bovino, la inseminación artificial presenta ventajas de tipo genético y sanitario; y en ella se utiliza principalmente semen congelado. El número de células apoptóticas aumenta en comparación con el semen fresco, ya que las bajas temperaturas ocasionan daños en los espermatozoides a nivel de sus membranas: plasmática y acrosomal, en la mitocondria y en la vaina del anoxema. Los espermatozoides dañados generan grandes cantidades de especies reactivas de oxígeno (ROS). Estas atacan a moléculas susceptibles al deterioro oxidativo tales como los lípidos insaturados de las membranas celulares espermáticas, induciendo la reacción de peroxidación lipídica, siendo el malondialdehído (MDA) un producto indicativo de un proceso avanzado. Este se infiere mayormente a partir de la determinación del complejo que forma con el ácido tiobarbitúrico (TBA), y que puede ser analizado por espectrofotometría UV-Visible. Sin embargo otras moléculas, tales como azúcares y aminoácidos, también pueden reaccionar frente al TBA. Otra técnica más específica es la cromatografía líquida de alta presión (HPLC). El objetivo de este trabajo fue validar, mediante HPLC con detección de arreglo de diodos (DAD), un método de cuantificación de MDA, como un parámetro de calidad seminal luego de la criopreservación. Se utilizaron pajuelas congeladas en N2 líquido de un mismo eyaculado de un toro Braford. El nivel de MDA se determinó por derivatización con TBA. Las mediciones se realizaron en una columna de tipo fase reversa y por elución en gradiente. La respuesta del DAD fue lineal en el rango 0,0565 a 5,42 µM (R2=0,9973). La exactitud del método fue evaluada por la adición de MDA estándar a la muestra en estudio y en concentraciones intermedias dentro del rango de linealidad. El porcentaje de recuperación fue 91,8%. La precisión se estudió mediante el análisis por triplicado de réplicas. Los coeficientes de variación (CV%) intra e interdía fueron 3,73 y 3,84%, respectivamente. Los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) se calcularon sobre la base de una relación señal-ruido 3:1 y 10:1 respectivamente. Estos resultaron en 0,0345 µM para LOD y 0,0459 µM para LOQ. La precisión y exactitud se encuentran dentro de los valores aceptables para fluidos biológicos. Entonces, el procedimiento analítico propuesto es selectivo, sensible y reproducible para la determinación de MDA en muestras de semen bovino criopreservado como un indicador de su estado oxidativo.