El dominio catalítico de CopA aislado conserva propiedades enzimáticas de la proteína completa

LUIS M. BREDESTON; JOSÉ M ARGUELLO; F. LUIS GONZÁLEZ FLECHA

Buenos Aires

Congreso; XL Reunion Anual de la Sociedad Argentina de Biofisica; 2011

Sociedad Argentina de Biofisica

La proteína de membrana CopA del extremófilo Archaeoglobus fulgidustransporta Cu+ desde el citosol hacia el espacio extracelular. Pertenece a la subfamilia PIBde P-ATPasas, que transportan activamente metales pesados, utilizando la energía provista por el ATP. Por su estabilidad y reducido tamaño es utilizada como modelo para estudios de estructura-función de dos Cu+-ATPasas cuyos defectos producen las enfermedades de Menkes (ATP7A) y de Wilson (ATP7B) en humanos.En un estudio previo (1) mostramos que la actividad fosfatasa (capacidad de hidrolizar p-Nitrofenilfosfato) de CopA purificada en micelas mixtas deasolectina/DDM, es dependiente de la temperatura con un máximoalrededor de 70 oC, de la presencia de iones Mg2+ y de una fracción molar de 0.4 de asolectina en la micela. Sin embargo es independiente de los ligandos Cu+ y Na+ que si son necesarios durante el ciclo de hidrólisis de ATP. Para estudiar en detalle el papel del dominio catalítico de CopA, este fue expresado en E. coli con un tag de histidina en el C-terminal (CopADC- his6) y luego purificado por cromatografía de afinidad. La evaluación de la actividad fosfatasa y ATPasa de CopADC-his6 en función de la temperatura mostró que ambas curvas se superponen con un máximo alrededor de 70-80 o C. La energía de activación fue característica para cada actividad con valores de 56 y 95 KJ/mol, respectivamente. Estos son similares a los obtenidos para las mismas actividades en CopA indicando que el dominio aislado contiene los componentes estructurales que le confieren termofilicidad. Además durante el ciclo de hidrólisis de ATP por CopADC- his6 se forma un intermediario fosforilado. La afinidad aparente pon el Mg2+ durante la actividad fosfatasa de CopADC-his6 (K0.5=13 mM) fue menor respecto a CopA (K0.5= 1 mM) indicando que otros componentes de CopA podrían participar en la afinidad por el catión. La disminución de la actividad fosfatasa en presencia de concentraciones crecientes de ATP indicó que ambos sustratos se unirían compitiendo por el mismo sitio.