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INTRODUCCIÓN: Las células animales constituyen actualmente la plataforma principal para la producción de proteínas recombinantes de aplicación clínica. Este hecho se relaciona directamente con su capacidad de realizar un plegamiento proteico correcto y complejas modificaciones postraduccionales. Teniendo en cuenta que la glicosilación afecta muchas propiedades de las glicoproteínas, incluyendo estabilidad, biodistribución, farmacocinética e immunogenicidad, en nuestro grupo de trabajo se obtuvo, mediante técnicas de glicoingeniería, una muteína derivada de IFN-alfa2b humano (hIFN-alfa2b) en la cual se adicionaron 4 sitios de N-glicosilación (IFN4N). La mencionada proteína, expresada en células CHO-K1 y HEK-293T, exhibió una profusa glicosilación y un aumento en su actividad biológica in vivo en animales con respecto a la proteína original. Los exitosos resultados obtenidos estimularon la proyección del escalamiento del proceso de producción de la misma. La producción de proteínas en cultivos de células de mamífero a gran escala implica la necesidad de reducir componentes de origen animal del medio de cultivo, como el suero fetal bovino (SFB), debido a cuestiones de bioseguridad y simplificación de los procesos de purificación posteriores. Por otra parte, existen numerosas estrategias tendientes a mejorar la productividad celular, entre las cuales se encuentran la hipotermia suave de los cultivos. Se ha observado que la aplicación de temperaturas entre 30-35ºC resultó en una activa reducción del crecimiento celular y un incremento de la velocidad de síntesis de proteínas recombinantes. De esta manera, el objetivo del presente trabajo consistió en la adaptación de clones de células CHO-K1 y HEK-293T productoras de IFN4N al crecimiento en suspensión, evaluando su posterior comportamiento a nivel de productividad celular y calidad de glicoproteína producida en condición de una suave hipotermia del cultivo. METODOLOGÍA: Adaptación a crecimiento en suspensión: Se llevaron a cabo dos protocolos de adaptación: uno de ellos consistió en el remplazo parcial y progresivo del medio de cultivo original de las células adherentes (medio con suero) por un medio comercial para células en suspensión (medio libre de suero), para los clones derivados de células CHO-K1 (clones P1B8 y P4D3). El otro protocolo se basó en una reducción inicial de la cantidad de suero del medio de cultivo original y posterior subcultivo directo a un medio comercial libre de suero, para el clon derivado de células HEK 293T (clon P2A5). Caracterización del crecimiento y del metabolismo celular: Para analizar las características metabólicas básicas de los clones adaptados al crecimiento en suspensión se realizaron curvas de crecimiento en frascos spinner. A partir de las mismas se analizó el metabolismo de glucosa, lactato, amonio y producción de IFN4N, determinando las correspondientes velocidades de consumo o producción, como así también la velocidad de crecimiento celular y la viabilidad. Evaluación de la calidad molecular y funcional de la molécula: Se evaluó la calidad del IFN4N en términos de perfil electroforético mediante ensayos de SDS-PAGE/Western blot y determinando el perfil de isoformas mediante isoelectroenfoque (IEF)/Western blot. Asimismo, se llevó a cabo la evaluación funcional mediante determinación de la actividad biológica específica (ABE) antiviral y antiproliferativa específica in vitro. Análisis de la estabilidad de la producción específica: Se realizaron ensayos para determinar la productividad celular de IFN4N cada 7 días durante un período de 70 días. Análisis del descenso de la temperatura sobre los parámetros de crecimiento y producción: Se llevaron a cabo curvas de crecimiento a dos temperaturas (37°C y 33°C) en paralelo, determinando diariamente concentración celular, viabilidad y concentración de IFN4N. RESULTADOS: Luego de 66 días (clones de células CHO-K1) y 38 días (clon HEK-293T), se logró la completa adaptación al crecimiento en suspensión en medio libre de suero obteniéndose células capaces de crecer en suspensión de forma independiente o en pequeños agregados celulares. Posteriormente, se analizó el metabolismo básico de los clones capaces de crecer en suspensión en medio libre de suero (clones sP1B8, sP4D3 y sP2A5), determinando los parámetros de velocidad de producción de la muteína, lactato y amonio, y velocidad de consumo de glucosa. En todos los casos, los parámetros obtenidos fueron similares a aquellos correspondientes a las células de crecimiento en adherencia. Por otra parte, se analizó la calidad de la molécula producida mediante el análisis del perfil electroforético de glicosilación y perfil de isoformas de la proteína producida en ambas condiciones (adherencia y suspensión), no observándose diferencias entre ambas. Asimismo, tampoco se observaron diferencias en la funcionalidad de ambas moléculas, evaluada mediante la determinación de su actividad biológica específica antiviral y antiproliferativa in vitro. Estos resultados indican que el proceso de adaptación a crecimiento en suspensión no modificó las características metabólicas básicas de las células ni las inherentes al producto de interés, el IFN4N. Al analizar la estabilidad de la productividad específica de IFN4N en el tiempo no fue observada, en ningún caso, una clara tendencia de disminución de la producción específica a lo largo del tiempo evaluado. Finalmente, se analizó el efecto del uso de temperaturas subfisiológicas sobre el crecimiento celular y la producción de IFN4N. Para todos los clones, luego de una condición de suave hipotermia, se observó preservación de una elevada viabilidad celular durante un período prolongado de tiempo. No obstante, el efecto del descenso de temperatura sobre la máxima densidad celular, la producción específica y la producción acumulada de IFN4N fue completamente variable para todos los clones. Para el clon sP1B8, el empleo de una temperatura de 33ºC resultó atractivo desde el punto de vista tecnológico. Para el mismo, el cultivo a 33ºC alcanzó una densidad celular máxima superior a la alcanzada por el control a 37ºC (1,8×106 cél.ml-1 versus 1,4×106 cél.ml-1, respectivamente), que además se mantuvo elevada durante un período mayor de tiempo, resultando en un incremento de la integral de células viables. Notablemente, la producción acumulada de la glicoproteína a 33ºC fue tres veces superior (30 µg.ml-1) con respecto a la obtenida a 37ºC (10 µg.ml-1), sin observarse diferencias apreciables en el perfil de glicosilación de la molécula producida a ambas temperaturas. Estos resultados denotan la incapacidad de predecir el comportamiento de los diferentes clones celulares productores y destacan la importancia de la caracterización de los mismos y la optimización de las condiciones de cultivo en pequeña escala como paso ineludible para el futuro escalamiento a fase productiva. CONCLUSIONES En conclusión, se logró obtener clones productores deIFN4N provenientes de células CHO-K1 y HEK293T adaptados al crecimiento en suspensión en un tiempo relativamente corto y se comprobó que las características de la molécula, responsables de su mejorada actividad biológica in vivo, no se ven afectadas durante el proceso de adaptación. Además, se demostró la estabilidad de la productividad específica de la proteína de interés en el tiempo y se analizó el efecto del uso de una temperatura subfisiológica en los parámetros de crecimiento y producción, encontrándose resultados atractivos a nivel de producción para uno de los clones en condición de suspensión. Todos estos elementos contribuirán a proyectar, a largo plazo, el escalamiento de la producción de la mencionada glicoproteína.

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