Desarrollo e Implementación de una Técnica de PCR en Tiempo Real para el Diagnóstico Molecular de la Infección por el Retrovirus HTLV-1.

CASTRO G; BALANGERO M; MATURANO E; GALLEGO S

Jornada; XIII Jornadas de Investigación Científica de la Facultad de Medicina en el marco del 4° Centenario de la Universidad Nacional de Córdoba.; 2012

Introducción: el virus HTLV-1 es el agente etiológico de la leucemia/linfoma a células T del adulto, de la paraparesia espástica tropical y de otras enfermedades inflamatorias. La infección con HTLV-1 ha sido ampliamente documentada en el mundo, existiendo zonas endémicas en Argentina. El virus HTLV se integra en el genoma de la célula (provirus) y se disemina con muy baja producción de viriones. Debido a esta característica, el método más apropiado para el diagnóstico molecular es la detección del ADN proviral por PCR. Por otro lado, la PCR en tiempo real es la única metodología disponible que permite cuantificar el número de copias de virus presentes en la muestra. No obstante, no existen técnicas comerciales disponibles para cuantificar este virus. Los antecedentes sugieren que la carga proviral elevada estaría relacionada con la progresión hacia la enfermedad. Objetivo: desarrollar e implementar una técnica de PCR en tiempo real para la detección y cuantificación del ADN proviral de HTLV-1 en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y aplicar la misma para cuantificar el provirus en muestras de sangre de individuos infectados con HTLV-1 sintomáticos y asintomáticos. Materiales y Métodos: Se estandarizó una PCR en tiempo real utilizando el sistema SybrGreen. El par de primers utilizado fue diseñado para amplificar una región del gen tax de HTLV-1 a partir de ADN de células MT-2. El número de copias de HTLV-1 se normalizó en función de la cantidad de ADN celular cuantificando, en paralelo, una región del gen de albúmina. Se evaluó el límite de detección y cuantificación y la reproducibilidad intra e inter-ensayo de la prueba. La metodología desarrollada se utilizó para determinar la carga proviral en PBMCs en una cohorte de 50 individuos con serología reactiva para HTLV-1. Resultados: El límite inferior de detección del ensayo fue de 1 copia, alcanzando el 100% de sensibilidad cuando se ensayaron al menos 5 copias de provirus por reacción. El rango de cargas provirales encontradas fue de 2,2x102 a más de 8,3x104 copias de provirus de HTLV-1 x106 PBMCs. Conclusiones: El ensayo tiene excelente rango dinámico, entre 105 y 100 copias por reacción, y muy buena reproducibilidad intra e inter-ensayo. La sensibilidad y el amplio rango dinámico logrado permiten la determinación de un amplio espectro de cargas provirales. Esta técnica es una valiosa herramienta para el estudio de la relación entre la carga proviral y la patogénesis de la infección.