Análisis funcional de genes relacionados con estrés oxidativo en Arabidopsis thaliana

SCARPECI TE; ZANOR MI; BONDINO HG; CARRILLO N; VALLE EM

Santa Rosa, La Pampa, Argentina

Simposio; XXV Reunión Argentina de Fisiología Vegetal, Simposio de estrés ambiental.; 2004

Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal

El estrés oxidativo se origina como consecuencia de un desbalance entre la generación y la eliminación de las especies reactivas del oxígeno (ERO) (Fridovich, 1999). Estas moléculas, como el radical anión superóxido (O2.), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (OH.), se producen por reducción univalente del O2 y son muy nocivas para la célula. En plantas crecidas bajo condiciones de estrés ambiental se produce un aumento considerable de los niveles de ERO. Los intentos realizados para generar plantas transgénicas resistentes a estrés ambiental por sobreexpresión de algún componente de la respuesta antioxidante han sido infructuosos. Recientemente, las ERO han sido involucradas en la via de señalización de la respuesta antioxidante. El objetivo principal de este trabajo de investigación es la identificación de nuevos componentes que participen en la respuesta antioxidante de las plantas. Para esto se están llevando a cabo dos estrategias que nos permiten identificar genes de expresión temprana (por microarreglos de oligonucleótidos) y tardía (por activación dirigida o activation tagging). Para el primer caso se emplearon GeneChips® de Affymetrix. El ARN se extrajo de plantas de A. thaliana crecidas en tierra durante dos semanas las cuales se sometieron durante 2 hs a un tratamiento con metil viológeno (MV), herbicida propagador de O2.. Los datos se analizaron con dos programas diferentes y se seleccionaron 621 genes que presentaron un cambio en la expresión génica de 2 veces o más en ambos análisis. Por medio de Northern blots se corroboraron los resultados obtenidos con los microarreglos de ADN. De todos ellos 57 genes estuvieron relacionados con la transducción de señales, 24 con la defensa celular, 20 factores de transcripción (FT), 18 heat shock proteins (HSP) y 100 genes de función desconocida. Se seleccionaron tres FT y 1 HSP que presentaron una inducción mayor a 6 veces frente a condiciones de estrés oxidativo. Con el objeto de estudiar el rol que cumplen en la planta estos FT y HSP, se generaron plantas de A. thaliana  que sobreexpresan estos genes. Se presentarán resultados de los tratamientos oxidativos con estas plantas.En el segundo caso se empleó la "activación dirigida", técnica basada en la generación de mutantes de Arabidopsis por introducción de un T-DNA que contiene cuatro copias del enhancer del promotor constitutivo 35S CaMV. El T-DNA se inserta al azar en el genoma de la planta y de esta forma los enhancers pueden causar la activación transcripcional de los genes cercanos (entre 380 a 3,6 Kb) (Weigel et al., 2000). Las 8550 líneas de "activación dirigida" fueron rociadas con una solución de MV 1 mM y al cabo de unos días solo 18 líneas lograron sobrevivir a estas condiciones severas de estrés oxidativo. Dos progenies consecutivas de estas líneas fueron sometidas a nuevos tratamientos con MV y finalmente 11 líneas fueron las que sobrevivieron.  Estas líneas fueron caracterizadas fenotípicamente y evaluado su comportamiento ante distintos tratamientos como: velocidad de crecimiento, degradación de clorofila, velocidad de fijación de CO2, rendimiento cuántico del PSII, pérdida de electrolitos, entre otras. La tolerancia a los tratamientos oxidativos de estas líneas fue variable entre ellas, aunque en todos los casos fue superior a las plantas controles.Los análisis de estos resultados serán mostrados en esta presentación.Referencias bibliográficasFridovich,I. 1999. Ann.N.Y.Acad.Sci. 893:13-18.Weigel, D. et al. 2000. Plant Physiol 122:1003-1013.