Caracterización de las isoformas de glutamina sintetasa en Lycopersicon esculentum

SCARPECI, TE; BOGGIO, SB; VALLE, EM

Rosario

Congreso; XIX Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario (SBR); 1999

Sociedad de Biología de Rosario

La biosíntesis de los aminoácidos y otros compuestos inorgánicos nitrogenados, se lleva a cabo mediante la asimilación del amonio. La acción combinada de la glutamina sintetasa (GS) y la glutamato sintasa (GOGAT) es considerada la ruta principal de asimilación del amonio en plantas superiores. GS cataliza la formación de glutamina a partir de glutamato, amonio y ATP. En plantas superiores GS es una proteína oligomérica constituída por ocho subunidades. Además existen dos isoformas de esta enzima una citosólica (GS1) y otra plastídica (GS2). Las proporciones relativas de GS1 y GS2 varían entre los distintos órganos de la planta (hojas, raíces y frutos).Los objetivos del presente trabajo fueron estudiar la distribución de las isoformas de GS presente en los distintos órganos de la planta de tomate. Para ello utilizamos la técnica de Western-blot y fue necesario la obtención de anticuerpos contra GS de tomate.Partimos del ADNc codificante de GS1 de tomate (Marro ML, 1996, Tesina de Lic. en Biotecnología, FCByF, UNR), el cual fue subclonado en un vector de expresión pET-32b. La proteína recombinante fue utilizada para la obtención de los anticuerpos anti-GS.Para el estudio de la distribución de GS en los distintos órganos, se realizaron geles nativos y desnaturalizantes de poliacrilamida, los cuales fueron teñidos por Coomassie y analizados por Western-blot. Además se determinaron en geles nativos las actividades de GS en los distintos órganos.Se observó actividad GS en raíz, hoja, fruto verde y no pudo ser detectada en fruto rojo aún cuando se emplearon altas cantidades de proteína. Los análisis inmunológicos realizados en geles nativos revelaron la existencia de varias isoformas, siendo la de menor movilidad electroforética la forma activa de la enzima. Cuando se realizaron geles desnaturalizantes y Western-blot se observaron dos tipos de subunidades de GS en raíz y fruto y un solo tipo en hoja.Estos resultados indicarían que GS1 y GS2 estarían constituídas por subunidades de diferente peso molecular ensambladas en arreglos de distinto número de subunidades. Además la forma activa observada de GS estaría constituída por el mayor número de subunidades (octamérico), siendo totalmente inactiva cualquier otra asociación de subunidades.El diferente grado de asociación de subunidades de GS en los distintos tejidos podría reflejar una regulación diferencial de las actividades enzimáticas.