Herramientas de Diagnóstico molecular para la detección de resistencia a Equinocandinas en Candida glabrata.

DUDIUK, CATIANA; LEONARDELLI, FLORENCIA; GAMARRA, SOLEDAD; GARCIA, GUILLERMO

Rosario

Congreso; XIV Congreso Argentino de la Sociedad Argentina de Infectología; 2014

Sociedad Argentina de Infectología

Introducción: Candida glabrata es la segunda especie más comúnmente aislada en candidemia a nivel mundial, ocupando en Argentina el tercer lugar. Su tratamiento se presenta como un reto terapéutico ya que esta especie presenta sensibilidad reducida a Anfotericina B y Fluconazol. Por este motivo, actualmente las equinocandinas son consideradas como la primera opción terapéutica en candidiasis invasoras. Estos antifúngicos actúan sobre la pared celular inhibiendo la subunidad Fksp del complejo enzimático 1,3-β-D-Glucan sintasa. Los Fksp, son codificados por tres genes homólogos (FKS1, FKS2 y FKS3) y presentan regiones conservadas denominadas hot spots. Sustituciones en estas regiones tienen una relación directa y estricta con las fallas terapéuticas a las equinocandinas. En la actualidad se observa un aumento creciente de aislamientos de C. glabrata resistentes a equinocandinas, lo que conlleva a la necesidad de utilizar pruebas de sensibilidad in vitro para guiar las decisiones terapéuticas. Sin embargo, estos métodos no se utilizan habitualmente en los hospitales debido al tiempo y al costo que implica. Además, estudios previos evidencian una pobre correlación entre valores de sensibilidad in vitro y los fallos terapéuticos. Dicha situación hace imprescindible mejorar las técnicas de detección de la resistencia clínica a las equinocandinas. Objetivo: Generar herramientas moleculares de diagnóstico de la resistencia a las equinocandinas en Candida glabrata basadas en la detección de mutaciones en las regiones hot spot de los genes FKS. Materiales y Métodos: Se realizó un estudio doble ciego utilizando 54 C. glabrata aisladas de pacientes con enfermedad fúngica invasora probada. De estas, 16 presentaban mutaciones en la regiones hot spot de los genes FKS1 y FKS2. La identificación de las cepas como C. glabrata se realizó por secuenciación del operon ribosomal (rDNA). La extracción de DNA se realizó por el método de fenol-cloroformo. Se utilizó una técnica de PCR multiplex de punto final con primers diseñados de manera que el extremo 3´ coincida con el nucleótido donde se producen las mutaciones responsables del fenotipo de resistencia. Así, esta reacción de PCR es positiva solo cuando la cepa es sensible a las equinocandinas (sin mutaciones). Los resultados fueron comparados con los valores de sensibilidad in vitro y de secuenciación de los genes FKS. Resultados: La técnica PCR multiplex presentó una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98.1%. De las 54 muestras analizadas, 38 cepas se caracterizaron correctamente como sensibles y 15 como mutantes resistentes. En una cepa se observó un falso resultado, presentándose como sensible a equinocandinas cuando en realidad tenia una deleción en el hot spot 1 de FKS2. Conclusiones: Se demuestra la utilidad de la técnica propuesta como herramienta para el diagnóstico de resistencia a las equinocandinas en C. glabrata, presentando como ventajas respecto a los métodos de referencia, la rapidez (44 horas más rápida), la objetividad, el bajo costo y la mejor correlación con los fallos terapéuticos. La limitación de esta técnica es la incapacidad de detectar deleciones en los hot spots.  Sin embargo, la frecuencia de este genotipo es bajo, registrándose en la bibliografía solo una cepa en el mundo.