Actividad promotora del crecimiento vegetal de bacterias endófitas de nódulos de maní: potencial aplicación al sistema de rotación de cultivos maní-maíz

IBAÑEZ, F., ARROYO, M.E., FABRA, A.

Jornada; XXVIII Jornada Nacional del Maní; 2013

Centro de Ingenieros Agrónomos de General Cabrera y zona

Introducción El grupo denominado bacterias promotoras del crecimiento de las plantas o PGPBs (del inglés Plant Growth Promoting Bacteria), incluye numerosos microorganismos que viven en el suelo y se asocian con distintas especies vegetales, facilitando o incrementando su crecimiento. La utilización de estos microorganismos en las prácticas agrícolas puede constituir una alternativa válida para incrementar la productividad de los cultivos en un esquema de producción sustentable y amigable con el medio ambiente, reduciendo la aplicación de agroquímicos. En nuestro laboratorio se obtuvo una colección de aislamientos bacterianos a partir del interior de nódulos de maní, representativa del área manisera de la provincia de Córdoba. Estos aislamientos fueron caracterizados fenotípica y genotípicamente, demostrando que dicha población es altamente heterogénea e incluye microorganismos pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Enterobacter y Klebsiella (ubicados en la Clase γ-Proteobacterias). Posteriormente, se determinó que los microorganismos pertenecientes a esta Clase no eran capaces de inducir la formación de nódulos en maní, y que carecían de genes de nodulación. Por lo tanto, estos aislamientos fueron considerados endófitos oportunistas, capaces de colonizar los nódulos preformados por la especie rizobiana compatible. Además, estos estudios demostraron que dichos endófitos de nódulos son capaces de promover incrementos significativos en distintos parámetros de crecimiento y nodulación de plantas de maní. En este marco, el presente trabajo contribuye a la caracterización de las propiedades promotoras del crecimiento vegetal de los aislamientos endofíticos de nódulos de la colección, así como también a la evaluación del efecto de su aplicación sobre el crecimiento de plántulas de maíz. Además, se analizó el carácter endofítico de los aislamientos en plántulas de este cultivo. Finalmente, y considerando la capacidad de los microorganismos para interactuar con diferentes especies vegetales, se evaluaron los efectos de su aplicación en un ensayo que simula una secuencia de rotación maní-maíz. Materiales y Métodos -Aislamientos bacterianos. Se utilizó una colección integrada por 7 aislamientos de Gammaproteobacterias endófitas de nódulos (pertenecientes a los géneros Klebsiella, Enterobacter y Pseudomonas), obtenida a partir de nódulos de plantas de maní cultivadas a campo. -Determinación de propiedades PGPB. Se analizó la capacidad de las bacterias para producir sideróforos, Ácido Indol-Acético (AIA) y de solubilizar fosfato. La síntesis de sideróforos se evaluó en placas de Petri conteniendo el medio CAS. La producción de AIA fue analizada cualitativamente mediante una reacción colorimétrica utilizando el reactivo de Salkowski y la capacidad para solubilizar fosfatos fue ensayada en placas de Petri conteniendo el medio NBRIP. -Inoculación de plántulas de maíz. Semillas de maíz híbrido NK900 TD MAX fueron esterilizadas superficialmente y pregerminadas. Las plántulas fueron inoculadas a los 4 días post-emergencia con una suspensión bacteriana preparada a partir de una colonia aislada transferida a medio de cultivo TY o, alternativamente, YEM. Los cultivos fueron incubados a 28ºC hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento (~1.109 UFC/ml). Posteriormente se tomaron 4-5 ml de estos cultivos que fueron depositados sobre la raíz de las plántulas. Cuando se inoculó simultáneamente más de una cepa bacteriana, éstas fueron cultivadas por separado en sus medios de crecimiento correspondientes, y luego se agregó 5 ml de cada uno de ellos a las macetas. Las plantas fueron cosechadas a los 30 días post inoculación y se registraron diferentes parámetros de crecimiento. -Determinación del carácter endofítico de los aislamientos en las raíces de las plántulas de maíz. Las raíces de las plantas fueron esterilizadas superficialmente. Luego, se pesó 1 gramo de tejido radical estéril y se le agregó 9 ml de solución fisiológica para obtener la dilución 10-1. Las raíces fueron homogeneizadas en morteros estériles para liberar los microorganismos del interior de los tejidos radicales. Posteriormente, se realizaron diluciones seriadas que fueron sembradas por triplicado en medio TY con el agregado de Cloramfenicol (40 mg/ml). Las placas se incubaron a 28ºC por 24 hs y los aislamientos obtenidos fueron repicados en el mismo medio. Finalmente, las colonias obtenidas fueron tipificadas mediante ERIC-PCR. Para confirmar la identidad de los aislamientos, el perfil ERIC obtenido a partir de los endófitos recuperados fue comparado con el de las cepas inoculadas. -Ensayos en sistemas simulados de rotación maní-maíz. Semillas de maní variedad Runner cultivar Tegua y maíz híbrido NK900 TD MAX fueron esterilizadas superficialmente y pregerminadas. Las semillas de maní se colocaron en macetas inoculadas con una mezcla del aislamiento endófitico y el simbionte (Bradyrhizobium sp. SEMIA 6144). Como sustrato se utilizó un suelo agrícola estéril con bajo contenido de fosfato (7 ppm). En los ensayos se incluyeron controles negativos (plántulas sin inocular), controles inoculados exclusivamente con Bradyrhizobium sp. SEMIA 6144 y controles fertilizados (regados periódicamente con una solución de KNO3 5 mM). Las plantas se cosecharon a los 60 días post-inoculación, y se determinó el peso seco y fresco de la parte aérea y radical, y número y peso seco de nódulos. Luego se colocaron, en las mismas macetas, las semillas de maíz. Tres macetas por tratamiento fueron reinoculadas con los aislamientos de Gammaproteobacterias, con el fin de aumentar su número en el sustrato. Las plantas se cosecharon luego de 28 días y se registró el peso seco y fresco de la parte aérea y radical y la longitud aérea. -Análisis estadístico de los datos. Los datos obtenidos fueron analizados mediante ANOVA, utilizando el paquete informático Infostat. Resultados El análisis de las propiedades promotoras del crecimiento reveló que todos los aislamientos fueron capaces de solubilizar fosfatos y producir AIA. Además, los aislamientos Pseudomonas sp. NCHA35, Pseudomonas sp. NVAM24 y Klebsiella sp. TT001 produjeron sideróforos. Posteriormente, se analizó la capacidad de estas bacterias para colonizar y promover el crecimiento de plántulas de maíz. Los ensayos de inoculación en este cultivo revelaron que los aislamientos fueron capaces de promover su crecimiento, ya sea inoculados individualmente o coinoculados en grupos conformados según su afiliación taxonómica. Sin embargo, los efectos observados en las coinoculaciones fueron superiores, sugiriendo la existencia de un efecto sinérgico entre los aislamientos. Por otra parte, los aislamientos Enterobacter sp. NMAN11, Enterobacter sp. NONC13, Pseudomonas sp. NCHA33, Klebsiella sp. TT001 y/o Klebsiella sp. NTI31 fueron capaces de colonizar el interior de las raíces de las plántulas de maíz. No obstante, la capacidad endofítica de los aislamientos no parece estar relacionada con el efecto promotor del crecimiento en este cultivo. Posteriormente, los aislamientos fueron inoculados a plántulas de maní, las cuales fueron sucedidas por plántulas de maíz, creciendo en condiciones controladas que simularon una rotación de cultivos. Los resultados obtenidos en la primera etapa de este ensayo (cultivo de maní) confirmaron la capacidad de los aislamientos para promover su crecimiento. Se destacaron los tratamientos conformados por la co-inoculación de Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 y Klebsiella, así como la de Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 y Pseudomonas, ya que incrementaron distintos parámetros de crecimiento con respecto al control sin inocular. En cuanto a la segunda etapa (cultivo de maíz), los resultados indicaron que numerosos tratamientos fueron capaces de incrementar significativamente distintos parámetros de crecimiento vegetal. Es interesante destacar que todos los tratamientos que implicaron reinoculaciones mostraron un incremento significativo en las variables medidas con respecto al control sin inocular. Discusión y Conclusiones Los aislamientos pertenecientes a la colección de endófitos de nódulos de maní presentan diferentes propiedades PGP, y son capaces de promover el crecimiento de plántulas de maíz ya sea coinoculados en grupos conformados según su afiliación taxonómica o inoculados individualmente. Además, algunos aislamientos son capaces de colonizar el interior de las raíces de este cultivo. Sin embargo, aún cuando esta capacidad puede representar una estrategia ecológica que incremente la persistencia de los microorganismos en los suelos, no parece estar relacionada con el efecto promotor del crecimiento observado. Las bacterias analizadas demostraron un interesante potencial para promover el crecimiento de plántulas de maní y maíz en un ensayo de rotación. Esta característica permitiría proponer la aplicación, al inicio de la rotación, de inoculantes bacterianos mixtos que promuevan el crecimiento de ambos cultivos. Sin embargo, y a pesar de su capacidad para persistir en los suelos, la reinoculación con los aislamientos luego de la cosecha de maní demostró ser una práctica más efectiva para la promoción del crecimiento del cultivo de maíz. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el conjunto de los ensayos realizados, se concluye que la coinoculación entre Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 y Klebsiella, y Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 y Pseudomonas representan una alternativa interesante para su utilización en sistemas agrícolas que impliquen rotación de cultivos maní-maíz. No obstante, resulta necesario comprobar la capacidad promotora del crecimiento de estos aislamientos en ensayos a campo. Subsidiado por Fundación Maní Argentino, ANPCyT, SECyT-UNRC.