Desarrollo de un método de diagnóstico basado en qPCR para la detección y tipificación de virus del Dengue

LIONEL URAN LANDABURU; DIEGO MENGUAL GOMEZ; DANIEL GHIRINGHELLI; MARCOS BILEN

Buenos Aires

Congreso; XXXIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2013

Sociedad Argentina de Virología

Introducción La fiebre del Dengue es una enfermedad endémica en Sudamérica, particularmente en Argentina, Brasil, Uruguay y Paraguay. Durante este año, se han confirmado 1.101.290 casos en la región, de severidad variada, y se ha declarado al 2013 como un año epidémico según la Organización Panamericana de la Salud. El agente etiológico de la fiebre del Dengue es un virus perteneciente a la familia Flaviviridae de genoma de ARN (+) conocido como Virus del Dengue, que presenta 4 serotipos distintos. En Argentina, las metodologías de diagnóstico más utilizadas se basan en ensayos serológicos, cultivo celular en células C6/36, o análisis molecular mediante RT-PCR. El empleo de metodologías de PCR en tiempo real para la detección del Dengue, tiene una aplicación limitada en los centros de salud de nuestro país debido a los altos costos de los reactivos y equipos (todos elementos importados). Este trabajo presenta el desarrollo de una metodología de detección basada en qPCR, empleando reactivos producidos y optimizados por una empresa biotecnológica argentina. Objetivo Desarrollo de un sistema de detección serotipo específico para el virus del Dengue, empleando un sistema de qPCR diseñado y optimizado para alcanzar altos niveles de especificidad y la sensibilidad. Desarrollo de una master mix de PCR en tiempo real optimizada para la detección del virus del Dengue. Metodología A partir de un análisis bioinformático de 320 secuencias (80 representantes de cada serotipo viral) se detectaron potenciales regiones para el diseño de primers consenso, primers serotipo-específico y sondas oligonucleotídicas. Se generaron clones de cDNA conteniendo los fragmentos genómicos (700 pb) de las regiones blanco encontradas. Utilizando estos clones como molde se realizaron reacciones de PCR de tiempo final y de tiempo real para evaluar la sensibilidad, especificidad y estabilidad del sistema. Para ello se analizaron diferentes parámetros de la reacción tales como concentración de primers, concentración de Mg+2, enhancers, estabilizantes, enzima y temperatura de hibridación, entre otros. Resultados En la región 3? UTR del virus se identificaron varias secuencias blanco específicas de serotipo o genéricas del virus de Dengue, que dieron lugar a la síntesis de distintos primers y sondas para emplearlos en las reacciones de PCR. Los ensayos de especificidad de los distintos oligonucleótidos diseñados en PCR de tiempo final y qPCR, mostraron un 100% de especificidad respecto a su serotipo. Resta realizar ensayos de validación con otros arbovirus. Los ensayos de sensibilidad en qPCR demostraron una capacidad de detección del orden de los 5-500 femtog de molde, equivalentes a 100-10000 moléculas de plásmido. Las pruebas de estabilidad y condiciones de almacenamiento, permitieron verificar que la master mix desarrollada conserva sus propiedades hasta 6 meses conservada a -20ºC y hasta 20 ciclos de descongelamiento. Conclusiones Se ha desarrollado un sistema de qPCR sensible y específico para la detección del virus del Dengue con potencial uso en muestras clínicas y/o vectores; restando la validación respecto de otros arbovirus. Se ha desarrollado una master mix nacional de qPCR mediante el trabajo conjunto Universidad/Empresa, abriendo las puertas a nuevos desarrollos y a la sustitución de importaciones.