Generación de un vector con resistencia a la terbinafina para estudios genéticos en micología.

LEONARDELLI, FLORENCIA; DUDIUK, CATIANA; GAMARRA, SOLEDAD; GARCIA, GUILLERMO

Congreso; II Congreso Bioquímico del Litoral; 2013

El estudio genético de los hongos se encuentra retrasado por la escasez de herramientas genéticas disponibles. Por ejemplo, actualmente se cuenta con solo dos marcadores de selección positiva o dominante (resistencia a higromicina B ?HYGB- y resistencia a Phleomicina). Esto supone una limitación a la hora de generar mutantes dobles, triples o cuádruples. Por este motivo, se planteó como objetivo del presente trabajo la generación de una nueva herramienta de selección positiva basada en la resistencia a terbinafina (TRB) utilizando el gen ERG1 de Aspergillus fumigatus mutado como casete de resistencia. Para obtener el casete de resistencia a TRB, en una primera etapa se amplificó el gen ERG1 de A. fumigatus utilizando como DNA molde el genoma extraído de A. fumigatus cepa LMDM31. Este gen posee un intrón que no podría ser procesado en muchas especies fúngicas una vez incorporado el vector, por lo que se debió eliminar. Para ello se realizó una PCR de fusión amplificándose primero los exones I y II por separado, y luego fusionándolos usando el par externo de primers. En este paso se introdujeron las mutaciones T1171C y G1264A para generar la resistencia a TRB y eliminar el sitio de restricción ApaI (facilita la identificación de transformantes), respectivamente. Posteriormente, los productos de las reacciones de PCR de fusión, previamente purificados, se ligaron al vector pGEM®-T easy (Promega) y se transformaron bacterias Escherichia coli TOP10 (Invitrogen). Este casete de resistencia se probó con éxito en Aspergillus fumigatus. Sin embargo, C. glabrata, el vector no implicó reducción de la sensibilidad a TRB por lo que no será útil para estudios genéticos en esta especie. Actualmente se está probando en C. parapsilosis sensu stricto y A. terreus.