Obtencion de cepas de Candida glabrata defectivas en FKS2 y FKS3. Implicaciones en la resistencia a las equinocandinas y en la tolerancia al estres.

DUDIUK, CATIANA; LEONARDELLI, FLORENCIA; GAMARRA, SOLEDAD; GARCIA, GUILLERMO

Paran¨¢

Congreso; II Congreso Bioqu¨ªmico del Litoral; 2013

Las infecciones causadas por Candida glabrata son una causa importante de morbilidad y mortalidad en los pacientes inmunocomprometidos. Estas candidiasis se presentan como un reto terap¨¦utico ya que esta especie presenta sensibilidad reducida a los polienos y tiene la capacidad de adquirir resistencias secundarias a los triazoles con gran facilidad. Por el contrario, las equinocandinas han demostrado tener actividad frente a esta especie de levaduras. Estos antif¨²ngicos act¨²an sobre la pared celular inhibiendo  las subunidades Fksp del complejo enzim¨¢tico 1,3-¦Â-D-Glucan sintasa. Estas subunidades son codificadas por tres genes hom¨®logos (FKS1, FKS2 y FKS3). La resistencia cl¨ªnica a las equinocandinas en Candida spp., ha sido vinculada a mutaciones en regiones conservadas de las prote¨ªnas Fks1p y Fks2p, denominadas Hot Spot. Sin embargo, no se ha demostrado la funci¨®n individual de cada uno de estos genes en la resistencia a las equinocaindinas y en la tolerancia a condiciones de estr¨¦s celular. El objetivo de este trabajo fue la generaci¨®n de mutantes defectivos en los genes FKS2 y FKS3 para establecer su funci¨®n. Se generaron los vectores de deleci¨®n de los genes FKS2 y FKS3, utilizando en ambos casos el gen URA3 como casete de selecci¨®n por auxotrof¨ªa. En el caso del gen FKS2, el vector de disrupci¨®n se gener¨® utilizando la t¨¦cnica PCR fusi¨®n, mientras que en el caso del gen FKS3, el vector se gener¨® con enzimas de restricci¨®n. La transformaci¨®n de las levaduras se llev¨® a cabo utilizando el m¨¦todo del Acetato de Litio utilizado previamente en transformaciones de C. albicans. Se obtuvieron cepas de C. glabrata defectivas en los genes FKS2 y FKS3, con una eficiencia de recombinaci¨®n del 20 y 10% respectivamente. Estos resultados demuestran que el m¨¦todo de PCR fusi¨®n tiene la misma eficiencia en la generaci¨®n de vectores que el m¨¦todo tradicional (enzimas de restricci¨®n) pero con una mayor rapidez y flexibilidad. Por otro lado, el m¨¦todo de transformaci¨®n de levaduras estandarizado para C. albicans, resulto perfectamente aplicable para la transformaci¨®n de C. glabrata, observ¨¢ndose una mayor eficiencia de transformaci¨®n (5% para C. albicans). Estas cepas defectivas en los genes FKS2 y FKS3 se estudiaron fentot¨ªpicamente y se pudo concluir que el gen FKS2 participa en v¨ªas de tolerancia a pH extremos y a radicales de ox¨ªgeno. Sin embargo, ninguno de los mutantes estudiados present¨® alteraciones en su desarrollo cuando se utilizaron agentes que alteran la membrana citoplasm¨¢tica (antif¨²ngicos az¨®licos), la quitina de pared celular (rojo congo) ni la s¨ªntesis de beta glucanos.