Generación de vectores de disrupción del gen AKUBku80 y PYRG1 de Aspergillus terreus.

MACEDO, DAIANA; GARCIA, GUILLERMO

Santa Fe

Congreso; XVI Encuentro de jóvenes investigadores de la UNL - VII Encuentro de jóvenes investigadores de universidades de santa fe; 2012

La aspergilosis invasora (AI) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el paciente inmunocomprometido. Aspergillus terreus es uno de los principales agente etiológico de la AI. La mayoría de las especies del género Aspergillus son sensibles a todos los antifúngicos. Sin embargo, A. terreus es resistente natural a uno de los azoles más usados (fluconazol) y a Anfotericina B (polieno).  A pesar de la importancia clínica de esta especie, su estudio genético ha quedado relegado debido a la baja tasa de recombinación homóloga (menor del 5%) que presenta el género Aspergillus y a las escasas herramientas de selección disponibles. El estudio genético clásico se realiza por deleciones de genes específicos utilizando la técnica de transformación. Estas transformaciones, incluyen diversas técnicas pero todas producen roturas de las dobles cadenas de DNA en donde se insertan los vectores de deleción, constituyendo la forma más severa de los daños en el DNA que se han descrito. Los eucariotas cuentan con dos mecanismos de corrección de dicho daño: la recombinación homóloga y la recombinación heteróloga o no homólogas. La primera involucra la interacción entre secuencias génicas homólogas de 100 pb. a 1000 pb. , mientras que la última se produce por la unión directa de las cadenas de DNA independientemente de la secuencia de las mismas (18)( Tachibana, 2004). La  recombinación homóloga es el tipo de recombinación deseada a la hora de realizar el estudio genético clásico, ya que produce la deleción del gen de interés. En hongos filamentosos, la reparación de DNA se realiza preferentemente por recombinación heteróloga y por lo tanto el DNA exógeno se integra al genoma fúngico de manera aleatoria (10,17) (Nascimento et al., 2003; Silva Ferreira et al., 2006).   El proceso de recombinación heteróloga, es llevado a cabo por el complejo DNA ligasa IV-Xrcc4 y mediado por el heterodímero KU70-KU80. Este heterodímero es DNA-dependiente y tiene actividad protein kinasa (10,18) (Nascimento et al., 2003; Tachibana, 2004 ). La disrupción de uno de los componentes del heterodímero KU70-KU80 produce que toda reparación de daños en la doble cadena de DNA se produzca por recombinación homóloga (10)(Nascimento et al., 2003). En Aspergillus fumigatus, la deleción del gen akuBKU80, que codifica la subunidad Ku80p del heterodímero KU70/KU80, provoca que se incremente la integración homóloga de fragmentos exógenos de DNA a un 80% (17) (Silva Ferreira et al., 2006). El otro inconveniente a la hora de realizar estudios genéticos en especies patógenas de del género Aspergillus es que se dispone de solo 2 agentes de selección de transformantes (HygromycinB y Phleomycin) y que además son agentes de selección positiva. Esta última característica, hace que solo se puedan delecionar 2 genes en la misma cepa, uno con hygB y otro con phle. En especies fúngicas levaduriformes (Saccharomyces spp., Candida spp., etc.) se han utilizado vectores de selección por auxotrofía, que pueden ser reutilizados en la misma cepa, pudiéndose así delecionar más genes. Uno de los marcadores de auxotrofía más utilizados en micología es la auxotrofía a uracilo. Este fenotipo depende de la actividad del gen pyrG1 (6,21) (He et al., 2007; Weidner et al., 1998), que codifica la Orotidina 5´-monofosfato decarboxilasa (OMD). Esta enzima es esencial en el metabolismo uridina/uracilo y por lo tanto, su deleción lleva a auxotrofía.   Objetivo Generar un vector de disrupción del gen akuBKU80 de Aspergillus terreus para aumentar la frecuencia de recombinación homologa. Obtener un vector de disrupción del gen pyrG1 de A. terreus para así contar con una cepa con auxotrofía a uracilo y usar este fenotipo como herramienta de selección.