Caracterización estructural y estabilidad térmica del dominio extracelular de la proteína IA-2 en condiciones fisiológicas

PRIMO ME; SICA MP; RISSO VA; POSKUS E; ERMÁCORA MR

Carlos Paz, Córdoba

Congreso; XXXIV Reunión Anual Sociedad; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

IA‑2 es una proteína de 979 aminoácidos ubicada en membranas de gránulos secretores (GS) de tejido neuroendócrino. Desde su descubrimiento, IA–2 ha sido asociada con la diabetes mellitus insulino dependiente, inicialmente como uno de los principales autoantígenos, y más recientemente por su rol en la regulación de la expresión y secreción de insulina. Entre los autoantígenos asociados a diabetes, IA‑2 es única ya que se encuentra en la membrana de los GS y presenta un dominio N–terminal extracelular (IA‑2ec: residuos 35‑576) separado por una región transmembrana del dominio intracelular (residuos 601‑979). Luego de la exocitosis de los GS, IA‑2ec queda brevemente en contacto con el entorno extracelular y luego es rápidamente endocitado. Aunque se presume que IA‑2ec es un receptor de ligando desconocido, estas características nos llevaron a hipotetizar que IA–2 actúa en la transducción de señales entre el exterior y el interior de la célula. Durante la maduración del gránulo, IA‑2ec es digerido entre los aminoácidos 447‑448 por convertasas específicas, dando origen al dominio extracelular maduro de IA–2 (IA‑2ec449–576, residuos 449‑576). Nuestro laboratorio ha logrado producir IA‑2ec449‑576, demostrando que presenta propiedades autónomas de plegado (Manuscrito enviado). El objetivo del presente trabajo fue el estudio de las propiedades estructurales y la estabilidad térmica de IA‑2ec449‑576 en dos condiciones fisiológicas en las cuales se puede encontrar a la proteína durante el proceso de secreción: pH=4.7 (dentro de los GS) y pH=7 (en superficie celular). Para ello, IA–2ec449‑576 recombinante expresada en E. coli, se purificó por IMAC y luego por exclusión molecular a pH=7 (buffer fosfato) o pH= 4.7 (buffer acetato). Espectros de dicroísmo circular (CD) en el UV lejano y cercano revelaron un contenido similar de estructura secundaria y terciaria en ambas condiciones de pH. El análisis de los espectros de CD en el UV lejano (utilizando los programas SELCON, CONTIN, Varselec) determinó que IA‑2ec449‑576 posee un 26 % de estructura a hélice y un 24 % de lámina b. Resultados similares (27 % a hélice y 15 % de lámina b) se obtuvieron aplicando nueve algoritmos diferentes de predicción de estructura secundaria. La estabilidad de la proteína a ambos pH fue estudiada por desnaturalización térmica entre 0 y 90 ºC, monitoreada por CD a 220 nm. En ambas condiciones, la desnaturalización de IA‑2ec449–576 resultó altamente cooperativa, con temperaturas de transición de 61ºC y 70ºC a pH=7 y pH=4.7, respectivamente. Por lo tanto, nuestros resultados indican que IA‑2ec449‑576 es una proteína a+b cuyas características estructurales no varían con las condiciones fisiológicas estudiadas. Además, los parámetros termodinámicos demuestran que la proteína es ligeramente más estable en las condiciones en las que se encuentra dentro de los GS.