Estudio sobre el autoantígeno Tirosina Fosfatasa IA-2 involucrado en la Diabetes Mellitus Tipo 1: expresión del dominio antigénico IA-2ic

SICA MP; PRIMO ME; ERMÁCORA M; POSKUS E

Mendoza

Congreso; XII Congreso Argentino de Diabetes; 2000

Sociedad Argentina de Diabetes

La detección de autoanticuerpos hacia el dominio intracelular de la proteína IA-2 (IA-2ic o ICA512) ha probado ser útil en la predición de la Diabetes Mellitus (DM) Tipo I. Recientemente se ha demostrado que junto con los marcadores GADA e IAA sirve en el apoyo diagnóstico diferencial de las formas de DM en adultos. La técnica comúnmente usada para detectar el marcador sérico IA-2A es la inmunoprecipitación de 35S-IA-2 ó 35S-ICA512bdc sintetizados en cantidades muy bajas en sistemas de lisados de reticulocitos. Objetivo: Producir IA-2ic en bacterias, en cantidades suficientes para realizar ensayos inmunoquímicos y desarrollar un test de ELISA para IA-2A. Materiales y métodos: Por retrotranscripción (RT) de RNA total de páncreas humano se obtuvo un fragmento de cDNA codificante para un fragmento de IA-2 que comprende el dominio intracelular (ic). Por técnicas convencionales de ingeniería genética se prepararon vectores para la expresión del antígeno en bacterias E. coli BL21 (DE3)pLysS transformadas. La cantidad de protéina producida se estimó por SDS-PAGE y la actividad inmunoquímica se ensayó por Western Blotting (WB) utilizando sueros de pacientes con DM autoinmune y RIA aplicando el 35S-ICA512bdc preparado con un vector cedido por el Dr. G.S. Eisenbarth. Todas lass secuencias de DNA fueron confirmadas por secuenciación en la CRC-DNA Sequencing Facility de la Universidad de Chicago, USA. Resultados: Se obtuvo por RT el fragmento de DNA 1471-3095 de la secuencia registrada para IA-2. A partir de éste se obtuvo otro fragmento (1864-3095) que corresponde al dominio intracelular IA-2ic y que se introdujo en el vector pET9b, dando el vector pTICA7. Además se mutó un codón de bajo uso (codificante para R915) por otro de mayor uso dando el vector pTICAa13. 250mL de cultivo de E. coli transformadas con pTICA7 y pTECAa13 inducidos por IPTG produjeron <5ug y 700 ug de IA-2ic, respectivamente. En ambos casos el 50 % de la proteína se expresa en forma soluble. La caracterización del antígeno IA-2 por WB y RIA confirmó sus propiedades inmunoquímicas. Conclusiones: Los procedimientos desarrollados permitieron la obtención del antígeno IA-2ic recombinante, inmunoquímicamente activo, con suficiente rendimiento como para encarar su utilización en ELISAs. Junto con otro desarrollo de nuestro grupo para el marcador GADA, facilitará el acceso a los análisis prospectivos de baja complejidad y costo reducido.