Inmunosensor electroquímico usando analitos péptido-miméticos (fagos) para la determinación del herbicida atrazina

A. GONZÁLEZ-TECHERA; G. GONZÁLEZ-SAPIENZA; M. A. ZON; P. G. MOLINA,; H. FERNÁNDEZ; F. J. ARÉVALO

La Serena

Congreso; XXI Congreso de la Sociedad Iberoamericana de Electroquímica (SIBAE); 2014

Sociedad Iberoamericana de Electroquimica

La síntesis de analitos péptido-miméticos abre grandes oportunidades para el desarrollo de inmunoensayos. Estos péptidos pueden ser seleccionados desde una librería de fagos en una manera simple, sistemática y económica1. En este trabajo, se muestran resultados obtenidos en el desarrollo de un magneto-inmunosensor electroquímico (IE) empleando fagos (analito péptido-mimético) como un agente de reconocimiento de la interacción entre el analito y su anticuerpo monoclonal, el cual se encuentra inmovilizado sobre micro-partículas magnéticas (PM). Como analito de prueba se empleó el herbicida atrazina (AT), usado ampliamente en la industria agropecuaria. El fago empleado es el bacteriófago M13. Como muestra, se empleó agua superficial del Río Cuarto contaminada ?ex profeso?. El inmunosensor estuvo compuesto de PM de 3 mm de diámetro modificadas superficialmente con proteína G y de electrodos de láminas impresas de carbono (ELIC). Para la inmovilización de las PM sobre la superficie del electrodo se empleó un imán de neodimio de alto campo magnético. Como técnica electroquímica se utilizó cronoamperometría (CA). El ensayo fue llevado a cabo de una manera simple, rápida y precisa sin la necesidad de un pre-tratamiento de la muestra. RESULTADOS        La determinación de AT estuvo basada en un inmunoensayo no competitivo, en donde el fago empleado reconoce al inmunocomplejo formado por AT y su anticuerpo monoclonal (K4e7), el cual se encontró en una cantidad limitada inmovilizado sobre las PM. El fago presentó solo actividad frente al inmunocomplejo y no sobre AT o K4e7. La interacción entre el fago y el inmunocomplejo fue detectada empleando el anticuerpo monoclonal anti M13 (a-M13) (anti fago) conjugado con la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP). Luego, se agregó el sustrato enzimático (H2O2) conjuntamente con un mediador redox (pirocatecol, H2Q). HRP, en presencia de H2O2 cataliza la oxidación de H2Q a o-benzoquinona (Q), la cual es susceptible de ser reducida electroquímicamente. La corriente de estado estacionario obtenida fue proporcional a la cantidad de AT en la muestra.        Primeramente se determinó la cantidad óptima de PM, la cual se estudió en el intervalo comprendido entre 30 a 120 mg, encontrando una mejor respuesta de corriente para una masa de 60 mg, lo que permitió una correcta suspensión de las mismas, como así también un fácil manipuleo. Posteriormente, se optimizaron las concentraciones del anticuerpo K4e7 y de fago que permitieron una mejor performance del ensayo, empleando tanto técnicas colorimétricas como electroquímicas. Se eligieron concentraciones de 10 mg mL-1 de K4e7 y una dilución de 1:40 de fago, valores similares a los determinados por la técnica colorimétrica. Las técnicas colorimétricas empleadas fueron llevadas a cabo en placas de alta afinidad de 96 pocillos. Las adsorciones no específicas fueron minimizadas realizando un estudio de la corriente amperométrica en función de soluciones de leche descremada y/o de suero de ratón de diferentes concentraciones. Por otra parte, el a-M13 fue utilizado en una dilución 1:5000. Las concentraciones de H2O2 y H2Q también fueron optimizadas.        A partir de estos resultados se realizaron curvas de calibración alcanzado un límite de detección inferior a 2 ppb. Se realizaron pruebas de reproducibilidad y determinación de AT en muestras de agua superficiales de río, con porcentajes de coeficientes de variación (%CV) inferiores a 10 % y buenos valores de recuperación.