DETECCION DEL GENOMA DE α Y γ HERPESVIRUS BOVINOS EN SEMEN

FAVIER P; MORAN P; CATENA MC; CHIAPPARRONE ML; ODEON AC; VERNA AE; PÉREZ SE

Conferencia; XXXIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2013

Introducción. La inseminación artificial (IA) es una práctica ampliamente difundida con el fin de mejorar la genética del ganado. Una desventaja de esta metodología es la POTENCIALIDAD posibilidad de diseminación de enfermedades infecciosas a través del uso de semen contaminado. El herpesvirus bovino 1 (BoHV-1) es el principal agente viral asociado con desórdenes reproductivos en el ganado. Recientemente, el herpesvirus bovino 5 (BoHV-5) y el herpesvirus bovino 4 (BoHV-4) también han sido asociados con enfermedad reproductiva en el bovino. El BoHV-5, agente causal de meningoencefalitis no supurativa en terneros, fue detectado en casos de vulvovaginitis y aislado de semen de toros en ausencia de enfermedad clínica. El BoHV-4 es un gamma-herpesvirus que se aisló de animales sanos y de animales con signos respiratorios, oculares, metritis, vaginitis y abortos. En 2007, el virus se identificó en muestras de abortos bovinos y en semen en Argentina. Los alfa-herpesvirus (BoHV-1 y BoHV-5) establecen latencia en neuronas sensoriales del ganglio trigémino o sacro mientras que el BoHV-4 tiene como sitio de persistencia a los macrófagos/monocitos. El virus latente puede reactivarse periódicamente y transmitirse a hospedadores susceptibles a partir de distintas secreciones, incluyendo el semen. El objetivo de este estudio fue identificar la presencia de los genomas de BoHV-1, 5 y 4 en semen bovino. Materiales y Métodos. Se analizaron 67 muestras de semen de toros de rodeos de carne y leche, de origen nacional e importado, provenientes de centros de IA y de muestras obtenidas a campo. La extracción de ADN se realizó según lo descripto por Oliveira et al. (2011) a partir del semen diluido 1:20 en PBS. La detección de BoHV-1 y BoHV-5 fue efectuada por nested PCR, de acuerdo a lo descripto por Wang et al. (2001) y Campos et al. (2009), respectivamente. Para BoHV-4 se utilizó la PCR descripta por Wellemberg et al. (2001). Se incluyeron controles negativos (ADN de células MDBK no infectadas) y positivos (ADN de MDBK infectadas con cepas virales de referencia. La sensibilidad de las PCR se determinó mediante diluciones seriadas en base 10 de semen negativo, diluido 1:20, e inoculado con las cepas virales de referencia previamente tituladas. Alicuotas de ADN de cada dilución se sometieron a las distintas PCR. Resultados. Las nested PCRs para BoHV-1 y BoHV-5 fueron altamente sensibles para la detección de ADN viral en semen (5 x 10-6 and 4 x 10-4 TCID50, respectivamente). Como era esperado, la PCR convencional utilizada para BoHV-4 fue menos sensible (2 x 104 TCID50). El producto de amplificación específico para BoHV-1 se detectó en 4/67 (6 %) de las muestras. Todas las muestras de semen fueron negativas a BoHV-5 y BoHV-4. Las muestras positivas pertenecían a toros de razas lecheras alojados en centros de IA; una de ellas correspondió a semen importado. Discusión. El hallazgo más importante de este estudio es la detección del genoma de BoHV-1 en semen de toros pertenecientes a centros de IA y, particularmente, su identificación en muestras de semen de origen internacional, lo cual representa una importante consideración para la comercialización de semen con el propósito de mejorar la genética de los stocks ganaderos. Esto implica que la importación/exportación de semen demanda medidas y regulaciones más rigurosas para evitar la diseminación de enfermedades mediante transmisión venérea. Además, se demuestra la necesidad de utilizar pruebas diagnósticas más sensibles antes de que los lotes de semen sean aprobados para su comercialización. Si bien el aislamiento en cultivo celular continúa siendo la técnica estándar para la detección de virus en semen., entre sus desventajas se encuentran la citotoxicidad de la muestra, el tiempo y el costo de la técnica. El aislamiento en cultivo celular para diagnóstico de BoHV en semen tiene limitaciones adicionales, como la baja concentración de virus eliminado en estas secreciones durante la reactivación viral. En este estudio no fue posible detectar la presencia del genoma de BoHV-4. Aunque se desconoce la cantidad de partículas virales eliminadas en semen, es probable que esta sea igual o inferior al número de partículas de BoHV-1 excretadas. Las cepas de BoHV-5 se designan como subtipos “a”, “b” y “no a-no b”. La presencia transitoria del subtipo “b” solo se describió en Argentina. No obstante, las cepas circulantes más comunes pertenecen al subtipo “a”. Las cepas “no a-no b” se reportaron en Brasil pero no en Argentina, por lo cual sería importante determinar si las cepas de BoHV-5 presentes en nuestro país difieren en su tropismo por el tracto genital. Por lo tanto, es importante usar herramientas más adecuadas y sensibles para la identificación viral en este tipo de muestras. Asimismo se requerirán futuros estudios que involucren un mayor número de muestras para determinar si el semen bovino en Argentina es una ruta potencial de transmisión de estos virus. Referencias. Campos et al. (2009). High prevalence of co-infections with bovine herpesvirus 1 and 5 found in cattle in southern Brazil. Vet Microbiol. 139: 67-73. 2) Oliveira, et al. (2011). Detection of bovine herpesvirus 1 and 5 in semen from Brazilian bulls. Theriogenology 75, 1139-45. 3) Wang et al. (2001). Detection of bovine herpesvirus-1 in peripheral blood mononuclear cells eight months postinfection. J Vet Diagn Invest. 13:424-7. 4) Wellemberg et al. (2001). Detection of bovine herpesvirus 4 glycoprotein B and thymidine kinase DNA by PCR assays in bovine milk. J. Virol. Meth. 97:101-12.