OPTIMIZACIÓN DE LA TÉCNICA NESTED RT-PCR PARA LA DETECCIÓN DE INFECCIONES PERSISTENTES POR VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA EN SUERO

GONZALEZ ALTAMIRANDA E; LEUNDA MR; VERNA AE; ODEÓN A

Congreso; XIX Reunión Científica Técnica. AAVLD; 2012

Introducción: El virus de la Diarrea Viral Bovina (vDVB) causa un amplio rango de patologías, entre las cuales los desordenes reproductivos son los responsables de importantes pérdidas económicas. La fuente primaria de diseminación del virus es la presencia de animales persistentemente infectados (PI) [1]. Por este motivo, los esfuerzos para su control deben dirigirse a la detección y eliminación de los bovinos PI. La vacuna por sí sola no elimina a los animales con esta condición y debe emplearse como una herramienta para evitar la reintroducción de la infección a los rodeos saneados. La técnica “gold-standard” para la detección de animales PI es el aislamiento viral a partir de leucocitos. Sin embargo, la implementación de métodos de diagnóstico rápidos y sensibles, que permitan disminuir los costos de la detección es sumamente deseable. Técnicas moleculares como PCR cumplen con dicha premisa, teniendo la ventaja, gracias a su gran sensibilidad, de poder agrupar las muestras en pooles. El objetivo de este trabajo fue optimizar la técnica nested rt-PCR como prueba diagnóstica para la detección de animales PI a partir de pooles de suero. Materiales y Métodos: Se emplearon 6 sueros obtenidos de 4 hembras bovinas diagnosticadas como persistentemente infectadas con vDVB. Los sueros fueron conservados a -20º C. Se determinó el titulo viral de cada suero por el método de Reed & Muench, 1938 [2]. Se seleccionaron 99 sueros negativos a vDVB para realizar los pooles (Tabla 1). Como control negativo se empleo un suero libre de vDVB. Suero PI Titulo viral* Pooles (n/N) 1 1 x 104.1 1/9 1/99 2 1 x 102.5 1/9 1/99 3 1 x 102.8 1/9 1/99 4 1 x 102.5 1/9 1/99 5 1 x 103.1 1/9 1/99 6 1 x 106.7 1/9 1/99 Tabla 1: Sueros PI y pooles. *TCID50/ml; n: suero PI, N: sueros negativos a vDVB De cada pool se tomó un volumen de 200 μl y se procedió a la extracción de ARN mediante Trizol® según las especificaciones del fabricante, con modificaciones menores. La técnica nested rt-PCR fue modificada desde Hyndman et al., 1998 [3], para mejorar su sensibilidad. Brevemente, para la síntesis de cADN, 10 μl de ARN, 0.02 μM Random primers (Promega) y H2O depc 0.01 M en un volumen final de 16 μl, fueron desnaturalizados a 65º C durante 5 min y colocados en hielo. Posteriormente se agregó 9 μl de la mezcla para realizar la transcripción reversa según Hyndman et al., 1998 y se incubó a 37º C durante 90 min. La amplificación del cADN se realizó en un volumen total de 25 μl conteniendo 4 μl de cADN en una mezcla de reacción según detalla Hyndman et al., 1998. La misma fue sujeta a 94º C 1 min y luego a 30 ciclos de 95º C 1 min, 58º C 1 min y 72º C 1 min. Se adicionó un paso final de elongación de 72º C 1 min. La amplificación nested fue idéntica a la anterior. Dos microlitros de la primera ronda fueron sujetos a una segunda ronda de amplificación usando los primers internos: PESTI 3 (2 μM), PESTI 4 (2 μM). Se repitió el mismo número de ciclos en un termociclador Thermo PX2. Los productos amplificados de la nested fueron visualizados en gel de agarosa al 1.8% teñido con SYBR® Safe DNA gel stain (Invitrogen) bajo un transiluminador UV. Resultados y Discusión: Un producto de 171 pb característico de la región conservada 5’ UTR del genoma de vDVB fue detectado en el total de pooles de sueros analizados, independientemente del título viral de cada suero. Este producto no fue detectado en el pool con el suero control. La detección de vDVB a partir de pooles de sueros mediante una nested rt-PCR es un hecho relevante en el diagnostico rápido y eficaz de la presencia de animales persistentemente infectados en los rodeos. Si bien el aislamiento viral es el método de referencia, trabajos que han comparado el aislamiento viral con la técnica de rt-PCR en la detección de vDVB a partir de pooles de leche, han demostrado que la rt-PCR presenta mayor sensibilidad de detección [4]. En el presente trabajo se ha logrado detectar 1 muestra positiva a vDVB en pooles de hasta 100 muestras a partir de sueros positivos con un amplio rango de título viral (1 x 102.5 a 1 x 106.7 TCID50/ml). Por su parte, el rango de títulos seleccionados (aproximadamente 1 x 103.9 TCID50/ml) permitió establecer un promedio similar a las concentraciones registradas en sueros de animales PI, lo que indica que para esta técnica, aún animales con baja carga viral en suero, pueden ser detectados desde tamaños de pooles de 10 a 100 muestras. Cabe destacar también que las condiciones de almacenamiento de las muestras, el tiempo que transcurre desde la toma hasta su procesamiento y la temperatura de conservación tienen un impacto significativo sobre la recuperación del acido nucleico y la eficiencia de la nested rt-PCR. En este trabajo la conservación de las muestras y su posterior manipulación fueron realizadas bajo las mismas condiciones con el propósito de optimizar el resultado de la técnica. Considerando la situación endémica del vDVB en nuestro país, resulta relevante la optimización de una técnica que permita reducir el costo por muestreo, incrementando la sensibilidad de detección. La optimización de la presente nested rt-PCR cumple con estos objetivos ofreciendo la posibilidad de implementar un amplio control basado en la vigilancia y rápida detección de animales PI. Bibliografía: [1] Houe H, 1999. Vet Microbiol 64:135-144 [2] Reed LJ & Muench H, 1938. Am J Hyg 27:493-497 [3]Hyndman L, Vilcek S, Conner J, Nettleton PF 1998. J Virol Methods 71:69-76 [4] Renshaw RW, Ray R, Dubovi EJ 2000. J Vet Diagn Invest 12:184-186