INVESTIGADORES
GALLO CALDERON Marina Beatriz
congresos y reuniones científicas
Título:
DIAGNOSTICO MOLECULAR DEL VIRUS MOQUILLO CANINO
Autor/es:
GALLO CALDERON, MARINA; PERIOLO, OSVALDO; IGLESIAS, MARCELA; MATTION, NORA; LA TORRE, JOSÉ
Lugar:
Hotel Sheraton Mar del Plata
Reunión:
Jornada; VI Jornadas Internacionales de Veterinaria Práctica; 2009
Institución organizadora:
Colegio de Veterinarios de la provincia de Buenos Aires
Resumen:
INTRODUCCION: el Virus del Moquillo Canino (VMC) provoca una enfermedad altamente contagiosa y mortal que tiene un gran impacto sanitario en animales de compañía (tanto en hogares y en veterinarias como así también en criaderos) y en especies silvestres susceptibles. Vacunar es la forma más efectiva, económica y práctica de prevenir ó disminuir la incidencia de estas enfermedades. Como ejemplo de lo importante que es la práctica de la vacunación, se encuentra el caso de un brote de VMC en Indiana, Estados Unidos (EEUU) en los años 1992-1993, en el cual la falta de vacunación, aumentó 350 veces el riesgo de la enfermedad y en el cual el 93.8% de los casos fueron atribuidos a la falta de vacunación. Cabe aclarar en este caso, que para muchos de los dueños de los animales, el costo del tratamiento médico excedió el costo de los programas de vacunación. En nuestro país, sólo un 20% de los perros (se estima que hay en total aproximadamente 8 millones de canes domésticos) es atendido con regularidad en las veterinarias, ya sea por urgencias ó consultas preventivas. La cifra, difundida por la Cámara Argentina de la Industria de Productos Veterinarios (Caprove), refleja entonces que el 80% de los animales de compañía no está recibiendo una cobertura médica mínima. Además, sólo un 20-25% de los perros recibió alguna vacuna, pero se desconoce el porcentaje de animales que completó el esquema de vacunación y por lo tanto se encuentran protegidos contra estas enfermedades. Esto pone de manifiesto el gran riesgo en el que está sometida la población canina. En Europa y EEUU las mascotas tienen cubiertas las necesidades básicas y el 90% recibe atención médica (en EEUU existen leyes que lo establecen como obligatorio). En Argentina, los animales viven en un ambiente totalmente diferente al de otros países, hay muchos animales sueltos vagabundos y en esa situación hay una exposición muy alta a los virus. Es importante destacar, que el grado de desnutrición, stress, enfermedades parasitarias u otras enfermedades infecciosas, también contribuyen al estado general de inmunosupresión de los animales. Existe además, un bajo relevamiento de los casos e información sobre animales vacunados e infectados. La crisis económica de los años 2000-2001, llevó en nuestro país, a una disminución en la práctica de la vacunación, que trajo como consecuencia una disminución de la cobertura vacunal poblacional y un aumento de la circulación viral. Simultáneamente se produjo un aumento de la liberación de perros a la calle (estos animales abandonados, fueron liberados por lo general, sin vacunar y por consiguiente, susceptibles). Esta situación, sumada a la utilización de vacunas no actualizadas, provocó en los últimos años, un gran aumento de los casos de VMC, lo cual se observó tanto en nuestro país como a nivel mundial incluyendo animales vacunados. De acuerdo a la literatura internacional, la evolución genética y antigénica del virus, generó variantes no siempre protegidas por los anticuerpos generados por las cepas presentes en las vacunas. Las técnicas de diagnóstico más ampliamente utilizadas son: inmunofluorescencia, ELISA, e inmunohistoquimica, pero éstas no proporcionan un resultado rápido, y pueden resultar negativas para animales con una enfermedad crónica ó subaguda. El objetivo del presente trabajo fue por un lado, aplicar un método diagnóstico rápido, preciso y sensible para VMC como la RT-PCR (retrotranscripcion, seguida de la reacción en cadena de la polimerasa) y por otro lado, aplicar otras técnicas de biología molecular que permitan diferenciar las cepas virales presentes en las muestras clínicas (salvajes), respecto de las cepas vacunales. MATERIALES Y METODOS: con el objeto de evaluar la efectividad y de ajustar los parámetros de ejecución de la técnica de RT-PCR para la detección de un fragmento de 287 pares de bases (pb) del gen de la NP de VMC, se analizaron 4 vacunas comerciales disponibles en la Argentina. Por otro lado, se obtuvieron entre los años 2003 y 2008, 123 muestras clínicas, provenientes de perros domésticos sospechados de infección con VMC. Todas las muestras provinieron de animales de la Ciudad de Buenos Aires y alrededores, a excepción de 2 muestras que se obtuvieron en las provincias de Tucumán y Santa Fe. La muestra clínica de elección, fue la sangre coagulada la cual fue remitida al laboratorio en la mayoría de los casos, refrigerada (4 ºC). En todos los casos, se extrajo el material genético viral (ARN) con Trizol. Se amplificó específicamente, por RT-PCR un fragmento de 287 pb del gen de la Nucleoproteina (NP) que es una región conservada del genoma viral. Por otro lado, en algunos casos, se amplificó un fragmento de 871 pb del gen de la hemaglutinina (H), región variable del genoma. El ADN purificado a partir del fragmento de 871 pb, fue digerido con la enzima de restricción NdeI. RESULTADOS: en todas las vacunas comerciales analizadas, se detectó el fragmento específico de VMC comprobándose asimismo la efectividad de la técnica para poder detectar secuencias del genoma viral de VMC. Se determinó también el límite de detección de la técnica, el cual fue de 35 partículas virales para la NP. De las 123 muestras de sangre de perros recibidas en el laboratorio, con fines diagnósticos, 82 resultaron positivas para la detección de VMC. Además, 81 muestras (66 %) provinieron de animales vacunados, 29 (24%) provinieron de animales sin vacunar y 13 (10%) provinieron de animales cuyo estado de vacunación se desconocía. De acuerdo a los signos clínicos, la infección por VMC se había sospechado en un 79% de estos casos. Algunas de las muestras positivas para la NP fueron evaluadas para la H. El estudio de esta región del genoma viral, permite una clara diferenciación entre cepas salvajes y cepas vacunales, dado que la endonucleasa NdeI no tiene un sitio de reconocimiento en las cepas vacunales y sí lo tiene en las cepas de campo. DISCUSION: de los datos presentados, resulta claro que la técnica de RT-PCR es una herramienta diagnóstica rápida, específica y sensible para detectar la presencia de secuencias genómicas de VMC en muestras de perros con enfermedad clínica compatible con VMC. CONCLUSIONES: las herramientas de biología molecular aplicadas en el presente trabajo, permitieron además, diferenciar cepas vacunales respecto de las cepas salvajes.