Desarrollo de un inmunosensor amperométrico en flujo continuo/flujo detenido para la determinación de progesterona en muestras de suero

F. J. ARÉVALO; G. A. MESSINA; P. G. MOLINA; M. A. ZÓN; J. RABA; H. FERNÁNDEZ

Salta, Argentina

Congreso; XVI Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica, Salta, Argentina; 2009

Asociación Argentina de Investigaciones en Fisicoquímica y Química Inorgánica

Introducción La progesterona (P4) (4-pregnona-3,20 diona), una cetona , no saturada, es la principal hormona esteroide producida por el ovario, a través del cuerpo lúteo, en todos los animales y en la mujer. El monitoreo seriado de los niveles de P4 tiene gran importancia, en el área de sanidad veterinaria, a fin de poder diagnosticar una insuficiencia en las primeras etapas de gestación. En el área citada se utilizan, para determinar P4, kits comerciales de ensayos semi-cuantitativo (ELISA) y cuantitativo (RIA). Objetivos Desarrollar un inmunosensor amperométrico en un sistema de flujo continuo/frenado para cuantificar P4 a niveles de trazas en muestras de suero animal. Resultados La construcción del inmunosensor se basó en la unión covalente de un anticuerpo monoclonal antiprogesterona sobre un disco rotatorio de teflón, modificado en su superficie con vidrio de porosidad controlada funcionalizado con grupos 3-aminopropil. El mismo se inserta en una celda de flujo, que opera con un volumen de 20 µL y posee un electrodo de trabajo de disco de carbono vítreo, un alambre de plata como electrodo de pseudo-referencia y un caño de acero inoxidable, que posibilita la salida de la solución ?carrier?, que actúa como contraelectrodo. La determinación de P4 se realizó empleando un inmunoensayo enzimático competitivo. Se marcó P4 con una enzima (peroxidasa de rábano, HRP). La determinación de P4 se basó, luego del ensayo competitivo, en la electroxidación de una benzoquinona generada a partir de un ciclo catalítico en donde participa la HRP, su sustrato enzimático (H2O2, 1 mM) y el mediador rédox (catecol, 1 mM). La respuesta obtenida es inversamente proporcional a la concentración de P4 en la muestra. Se determinaron las concentraciones óptimas de anticuerpo monoclonal y la concentración de P4 unida a la HRP. Se determinó P4 en concentraciones menores a 0,5 ng mL-1, alcanzando una sensibilidad, definida como la pendiente de la relación lineal de la señal con la concentración, de 3,19 nA ng-1 mL. El coeficiente de correlación lineal entre la respuesta del inmunosensor amperométrico de flujo con respecto al de la técnica ELISA colorimétrica fue de 0,999, con una pendiente de 0,901 y una ordenada al origen de 0,106, lo que indica la muy buena correlación entre ambos métodos. Se logró determinar P4 en muestras de suero con una concentración de 1 ng mL-1. El porcentaje de recuperación fue de 108 %, encontrándose un coeficiente de variación de 4,02 % para 3 mediciones. La muestra de suero no necesitó pre-tratamiento previo. Las medidas electroquímicas se realizaron empleando un potenciostato BAS CV 27.