Germinación in vitro de Rodophiala bífida

RODRIGO, JUAN; ROSSELLÓ, FERNANDO; MARINANGELI, PABLO; CURVETTO, NÉSTOR

La Plata, Pcia. Buenos Aires

Congreso; 3º Congreso argentino de Floricultura; 2006

INTA

La generación de protocolos de cultivo in vitro de especies nativas del género Rodophiala, para micropropagación o como un pre-requisito para otras aplicaciones biotecnológicas es de gran utilidad científica, tecnológica y comercial. La germinación de semillas en medio estéril es una de las posibles vías para la obtención de plántulas in vitro que servirían como punto de partida (fase de establecimiento) para protocolos de micropropagación, inducción de callos y cultivo de suspensiones celulares. En el presente trabajo se informa la adaptación de técnicas de desinfección para el establecimiento in vitro de plántulas de Rodophiala bifida en forma axénica a partir de semillas. Se utilizaron semillas de la especie Rodophiala bifida con 92% de poder germinativo. Para el establecimiento in vitro de plántulas de Rodophiala bífida, se ensayaron las siguientes técnicas: Doble desinfección. Desinfección simple. Desinfección utilizando Plant Preservative Mixture (PPM™). En la doble desinfección (DD), el total de las semillas se sumergieron durante 1 minuto en etanol 70 % y luego se probaron 2 concentraciones de NaClO (1.2% y 0.8% de cloro activo) con 2 tiempos de exposición de las semillas (30 y 15 minutos, respectivamente). A la combinación de mayor concentración de NaClO y tiempo se la denominó “desinfección fuerte” (DDF), a la otra se la llamó “desinfección suave” (DDS). Luego, en ambos casos, las semillas se enjuagaron tres veces con agua estéril y se dejaron en el agua del último enjuague durante toda la noche para su imbibición. Al día siguiente se realizó la segunda desinfección con NaClO (0.8% de cloro activo) durante 20 minutos para la desinfección fuerte y 15 minutos para la desinfección suave, seguido por tres enjuagues con agua destilada estéril. En la técnica de desinfección simple (DS) las semillas se sumergieron durante 1 minuto en etanol 70 % y luego en una solución de NaClO (0.8% de cloro activo por 15 minutos seguido por tres enjuagues con agua destilada estéril.  Para la desinfección con  PPM las semillas se sumergieron y agitaron durante 12 horas en una solución al 2 %. Para todos los tratamientos se utilizó medio MS sin agregado de sacarosa. Además, para los tratamientos DS y PPM se ensayó  medio MS con el agregado de PPM al 0.1 %. Los porcentajes más bajos de energía germinativa y poder germinativo in vitro se observaron en los tratamientos de DS con y sin PPM en el medio de cultivo, que difirieron significativamente (p<0,01) del resto de los tratamientos in vitro. No se observaron diferencias significativas (p>0,05) entre los porcentajes de germinación in vitro de la DDF y la DDS, alcanzando porcentajes de 50% y 53% respectivamente. La desinfección con PPM fue la que produjo los mayores porcentajes de germinación in vitro, llegando al 100%, no encontrándose diferencias significativas entre los tratamientos con y sin PPM agregado al medio de cultivo. Notablemente, las semillas de los controles sobre papel no germinaron cuando se utilizaron las técnicas de DDF, DDS, y DS; significativamente distinto (p<0,01) de lo que ocurrió con las semillas desinfectadas con PPM, SD y EMB y siembra sobre papel, que alcanzaron altos niveles de energía germinativa y porcentajes de germinación. No se produjo contaminación en ninguno de los tratamientos in vitro cualquiera sea la técnica de desinfección utilizada. En los controles sobre papel DDF, DDS y DS, se observaron marcados signos de contaminación sobre las semillas, lo que posiblemente haya inhibido la germinación de las mismas.  A partir de los resultados precedentes, la técnica más apropiada de desinfección para la obtención in vitro, sin contaminación, de plántulas normales de Rodophiala bífida a partir de semillas, fue aquella en la cual se empleó PPM y su cultivo in vitro en presencia o ausencia de PPM en el medio de cultivo.