Caracterización de mutaciones missense en pacientes argentinos con Porfiria Variegata

GRANATA BX; MENDEZ, M; PARERA V; BATLLE A; ENRIQUEZ DE SALAMANCA R; ROSSETTI MV

Mar del Plata

Congreso; LV REUNION CIENTIFICA ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE INVESTIGACION CLINICA (SAIC).; 2010

SOCIEDAD ARGENTINA DE INVESTIGACION CLINICA (SAIC)

Las Porfirias son desórdenes metabólicos causados por la deficiencia parcial primaria de una de la enzimas del camino biosintético del hemo. Cuando la enzima deficiente es la protoporfirinógeno oxidasa (PPOX), se produce la Porfiria Variegata. Ésta es de herencia autosómica dominante, hepática, sintomatología mixta, manifestación adulta, penetrancia incompleta y asociada a un descenso del 50% de la actividad enzimática. Recientemente, en 18 pacientes aparentemente no relacionados, encontramos 4 defectos de splicing, 3 mutaciones missense y 2 pequeñas deleciones. Las mutaciones missense, estaban ausentes en 50 individuos normales y los valores de actividad enzimática del paciente y familiares asintomáticos fueron de aproximadamente el 50% con respecto a los controles. El objetivo de este trabajo fue corroborar que estas mutaciones,  p.E34V, p.W224G y p.G332A, eran realmente la causa de la enfermedad  mediante la expresión procariótica de las mismas. Utilizando como templado el vector pTRC-PPOX wt, que contiene el cDNA normal de la PPOX, obtuvimos los tres constructos correspondientes a las enzimas mutadas mediante mutagénesis sitio dirigida, con los cuales se transformaron bacterias E.coli JM109. Las bacterias transformadas se crecieron hasta fase logarítmica y se indujeron con 5mM de IPTG. Luego se centrifugaron, se resuspendieron en buffer y se lisaron por sonicación. Los desechos celulares se separaron por centrifugación y el sobrenadante se empleó como fuente enzimática para determinar la actividad in vitro. De acuerdo a los resultados obtenidos (Tabla 1) todas las mutaciones provocan un marcado descenso de la actividad enzimática, corroborándose así que estas son responsables del desarrollo de la Porfiria en los pacientes que las portan. Constructo Actividad específica (nmol PROTO/mg/h) Actividad residual (%) pTRC 0.21 0 pTRC – PPOX-wt 13.27 100 pTRC – PPOX- E34V 0.51 2.29 pTRC – PPOX – W224G 0.76 1.22 pTRC – PPOX – G332A 0.20 0