COMPARACIÓN DE CLONADO Y PIROSECUENCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN DE CUASIESPECIES DEL HIV-1.

FRANCO MORETTI,; FEDERICO BOLCIC,; JORGE FABIÁN QUARLERI; MANUEL GOMEZ CARRILLO.; HORACIO SALOMÓN

Congreso; III CONGRESO NACIONAL DE SIDA; 2011

SAISIDA

Introducción El conocimiento de la composición de cuasiespecies ante una infección viral tendría implicancias directas sobre el estudio de la dinámica de poblaciones y el pronóstico del éxito de una terapia antiviral. En este trabajo se compara la aplicabilidad de las técnicas de clonado versus pirosecuenciación en el estudio del dominio V3loop del gen env de HIV-1 como ejemplo representativo de variabilidad viral. Métodos Diecinueve amplicones cubriendo la región V3loop de HIV-1 fueron clonados en el vector ?pGEM-T easy vector? (clonado tradicional) y paralelamente por Secuenciación de Alto Rendimiento (pirosecuenciación) en la plataforma ?454 sequencing? (Roche) proporcionada por INDEAR, Rosario, Santa Fe. Se comparó el rendimiento de cada método mediante el cociente del NroVariantes detectadas/NroClones, cuyo resultado indica la probabilidad de sobreestimación de la frecuencia de las variantes en cada muestra. Resultados Se obtuvo un promedio de 18 ± 4 clones para cada muestra mediante clonado tradicional y 530 ± 190 lecturas por pirosecuenciación. El nivel de detección mínimo fue de 5,62% y 0,19% variantes minoritarias respectivamente. El número de cuasiespecies detectadas por muestra fue en promedio 6,84 ± 2,89 mediante clonado tradicional y mayor a 20 en todos los casos de pirosecuenciación (el software muestra sólo las 20 más frecuentes). La probabilidad de sobreestimación de la frecuencia de variantes minoritarias fue en promedio 0,39 ± 0,17 (clonado) y 0,04 ± 0,02 (pirosecuenciación). Conclusiones Si bien ambos métodos son aplicables para determinar la composición de cuasiespecies dentro de una muestra, las variantes que se encuentran en una proporción menor al 5,62% estarían ausentes del análisis utilizando el método de clonado, con lo cual se sobreestimaría la frecuencia de variantes minoritarias y se subestimaría el número de cuasiespecies. En este campo la utilización de herramientas con mayor rendimiento ampliaría el conocimiento de la evolución viral durante una infección y fortalecería el pronóstico frente a la aplicación de una terapia antiviral.