Aplicación de una tecnología de O-glicosilación para la obtención de nuevas variantes de rhIFN-alfa2b de segunda generación

DIANELA CRAVERO; AGUSTINA GUGLIOTTA; MARCOS OGGERO; NATALIA CEAGLIO; MARINA ETCHEVERRIGARAY; RICARDO KRATJE

Santa Fe

Simposio; V Simposio Latinoamericano de Tecnología de Cultivos Celulares (SLATCC); 2012

Laboratorio de Cultivos Celulares. FBCB. UNL

El interferón alfa humano (hIFN-alfa) comprende un grupo de proteínas con múltiples actividades biológicas (antiviral, antiproliferativa e inmunomoduladora) que impulsaron su desarrollo en forma recombinante para su aplicación en el tratamiento de enfermedades virales y tumorales. La principal desventaja de su empleo clínico radica en la aparición de numerosos efectos adversos causados por las múltiples y elevadas dosis que se deben aplicar debido a su rápida eliminación sanguínea. Basándonos en la capacidad de los glúcidos de disminuir la velocidad de depuración de glicoproteínas, se diseñaron dos variantes de rhIFN-alfa2b fusionando a sus extremos N- y C-terminal el péptido carboxi terminal (CTP) de la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana, que posee cuatro sitios de O glicosilación. Ambas moléculas (CTP-IFN e IFN-CTP) fueron expresadas transitoriamente en células CHO.K1 mediante lipofección con el ADNc quimérico correspondiente. Se realizó la cuantificación de los derivados de IFN en los sobrenadantes de cultivo mediante técnica de ELISA sándwich y se evaluó su bioactividad in vitro utilizando cultivos celulares. La actividad biológica específica (ABE) antiviral de las variantes CTP-IFN e IFN-CTP osciló entre un 66 y 74% respecto a la de la molécula nativa (IFNwt), respectivamente, mientras que la ABE antiproliferativa se mantuvo prácticamente invariable (92 y 112%). En ensayos de SDS-PAGE e isoelecroenfoque seguidos de Western blot, ambas variantes mostraron perfiles electroforéticos con masas moleculares superiores y con mayor número de isoformas en la región acídica respecto al IFNwt, indicando el éxito de la incorporación del CTP y de nuevos carbohidratos que aportan mayor contenido de ácido siálico. Estos resultados permiten concluir que la O glicoingeniería constituye una metodología de gran utilidad para incrementar el tamaño molecular y la carga de citoquinas en vistas de mejorar su farmacocinética.