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Las pectinas se encuentran entre los principales constituyentes de la pared celular de los vegetales. Diversos estudios muestran a la pectina formada por varios dominios o regiones. Una de ellas es el homogalacturonano (HG), que es un polímero lineal formado por residuos de ácido D-galacturónico (AGA) unidos mediante enlaces α-D-(1→4). El hongo filamentoso Aspergillus kawachii IFO 4308 se caracteriza por producir diversos tipos de pectinasas. De ellas las más ampliamente estudiadas han sido las poligalacturonasas (PGasas), que son glicosidasas que hidrolizan las uniones α-D-(1→4) de AGA en el HG. Las denominadas PGasas ácidas tienen la propiedad de ser activas aún a valores de pH cercanos a 2. El atractivo tecnológico que presentan las PGasas ácidas es que las condiciones de actividad resultan muy interesantes para su uso en extracción de pectina y/o maceración, ya que en dichas condiciones de acidez es más fácil evitar la contaminación de la mezcla de reacción. Una de estas enzimas, denominada PG1, es la PGasa ácida dominante cuando se emplea glucosa como fuente de carbono, y la misma ya ha sido purificada, caracterizada y clonada por el grupo de enzimas hidrolíticas del CINDEFI. El presente trabajo tiene por objeto realizar un screening de las PGasas activas a pH 2,2 de cultivos de A. kawachii con pomaza de limón como fuente de carbono y energía, y demostrar que en presencia de pomaza se induce y predomina una PGasa ácida diferente a la PG1, a la que se la ha denominado PG1. Metodología A. kawachii se cultivó en un medio líquido a base de sales, triptona y pomaza de limón como fuente de carbono. El cultivo se realizó en erlenmeyer agitado a 30°C y 200 rpm durante 30 horas en oscuridad. Una vez finalizado, el cultivo se filtró a través de tela muselina y prefiltros de fibra de vidrio. Volúmenes de 20 ml se transfirieron a tubos Falcon y se liofilizaron. Para el screening de actividad PGasa, el liofilizado se resuspendió con 2,5 ml de agua destilada, se centrifugó 5 minutos en microcentrífuga (6000 rpm) para eliminar cualquier resto de material insoluble y se desaló con una columna PD-10 equilibrada con buffer acetato de sodio (AcB) 20 mM pH 5,0. Se realizó una cromatografía de intercambio iónico de las PGasas mediante una columna Resource Q 1ml equilibrada con el mismo buffer. Luego de adicionar 500 μl de muestra, la columna se lavó con 5 volúmenes de AcB y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0-500 mM en el buffer). La velocidad de flujo fue de 1 ml/min y el volumen de las fracciones fue de 1 ml. La actividad PGasa se determinó empleando ácido poligalacturónico (APG) como sustrato y midiendo el incremento de grupos reductores por el método de Somogyi-Nelson. El valor de pH para determinar la actividad PGasa ácida se fijó en 2,2 debido a que a valores de pH más bajos se observa una disminución significativa de la solubilidad del APG, con formación de agregados. Para verificar la existencia de una enzima activa a pH 2,2 que difiere de la PG1, se realizaron cromatografías similares usando como muestra una suspensión de PG1 recombinante, ya sea sola o bien combinada con fracciones activas asociadas a la PG1. Resultados y conclusiones En experimentos previos se demostró que el filtrado de un cultivo de Aspergillus kawachii (empleando tanto glucosa como pomaza de limón como fuente de carbono) produce dos picos bien resueltos de actividad PGasa a pH 2,2 cuando se aplica a una columna Resource Q equilibrada con AcB 20 mM pH 5,0 y se eluye con un gradiente lineal de NaCl. Los picos se observaron a una concentración de NaCl en el eluyente de 150 y 350 mM, y se atribuyeron a PG1 y PG1, respectivamente. Aunque ambos picos se observan en los cultivos ya sea con glucosa o con pomaza, la distribución de la actividad PGasa a pH 2,2 varía marcadamente con la fuente de carbono empleada. Mientras que en un medio con glucosa el pico predominante corresponde a la PG1, al emplear pomaza de limón el pico principal es el correspondiente a la PG1. En el presente trabajo se comprobó la presencia de ambos picos y el predominio de la PG1 cuando se emplea pomaza de limón como fuente de carbono. Los resultados se muestran en la figura 1: Fig. 1. Cromatograma de intercambio aniónico de PGasas activas a pH 2,2 producidas por A. kawachii en medio con pomaza de limón. 500 μl de muestra proveniente de un cultivo de 30 horas se inyectaron en una columna Resource Q 1 ml equilibrada con AcB 20 mM pH 5,0. Se lavó con 5 volúmenes de columna y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl en el buffer de 0 a 500 mM a lo largo de 20 volúmenes de columna. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min y el volumen de las fracciones recolectadas fue de 1 ml. Para demostrar que el pico correspondiente a una concentración de NaCl 150 mM corresponde a una enzima distinta a la PG1, se realizó una cromatografía empleando las mismas condiciones pero utilizando como muestra una dispersión de PG1 recombinante purificada (920 mU/ml a pH 2,2). Se observó un pico de actividad que corresponde a una concentración de NaCl en el eluyente del orden de los 350 mM. Los resultados se observan en la figura 2. Por otro lado se juntaron las tres fracciones más activas (12-14) de la cromatografía correspondiente a la figura 1, se desalaron con una columna PD-10 equilibrada con AcB 20 mM pH 5,0, y se mezclaron con 800 mU de PG1 recombinante purificada. El cromatograma resultante se observa en la figura 3. Fig. 2. Cromatograma de intercambio aniónico correspondiente a la enzima PG1 recombinante purificada. 500 μl de una dispersión de PG1 recombinante purificada se inyectaron en una columna Resource Q 1 ml equilibrada con AcB 20 mM pH 5,0. Se lavó con 5 volúmenes de columna y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl en el buffer de 0 a 500 mM a lo largo de 20 volúmenes de columna. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min y el volumen de las fracciones recolectadas fue de 1 ml. Fig. 3. Cromatograma de intercambio aniónico correspondiente a una mezcla de PG1 recombinante purificada con las fracciones 12-14 de la fig.1. 500 μl de muestra se inyectaron en una columna Resource Q 1 ml equilibrada con AcB 20 mM pH 5,0. Se lavó con 5 volúmenes de columna y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl en el buffer de 0 a 500 mM a lo largo de 20 volúmenes de columna. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min y el volumen de las fracciones recolectadas fue de 1 ml. Los resultados anteriores confirman que PG1 y PG1 son dos enzimas cuyas propiedades bioquímicas difieren lo suficiente como para poder separarlas cromatográficamente. Por otra parte, las diferencias cuantitativas observadas de acuerdo a la fuente de carbono empleada podrían indicar que PG1 es una enzima constitutiva, mientras que PG1 es una enzima cuya síntesis se induce por los componentes de la pectina presente en la pomaza de limón. La separación mediante cromatografía de intercambio aniónico será por lo tanto un punto clave en la subsiguiente purificación de la enzima inducible.