Evaluación de la capacidad funcional de las secuencias promotoras de la toxina Shiga (STX) en células eucariotas

BILEN MARCOS; LETICIA V. BENTANCOR; MARÍA P. MEJÍAS; GHIRINGHELLI DANIEL; MARINA S. PALERMO

Cordoba

Congreso; XXXII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2012

Introducción Las toxinas Shiga (STX) representan el principal factor de virulencia asociado a las infecciones enterohemorragicas causadas por Escherichia coli. STX pertenece a la familia de toxinas bacterianas AB5 (una subunidad A y cinco subunidades B) que tienen la capacidad de inhibir la síntesis proteica en células eucariotas. Los genes que codifican para STX están localizados generalmente, en el genoma de fagos lisogenicos integrados al genoma de Escherichia coli. Diferentes condiciones de estrés pueden inducir al ciclo lítico del fago, produciendo gran cantidad de STX y partículas virales que facilitan la dispersión de los genes stx infectando otras bacterias e inclusive transduciendo células eucariotas. Objetivos El objetivo del presente trabajo fue estudiar la relación entre el fago 933W y el contexto celular eucariota y determinar su importancia en el desarrollo de la enfermedad. Metodología y Resultados Se analizó in silico la secuencia genómica del fago 933W en búsqueda de potenciales motivos reconocidos por la maquinaria celular eucariota. Particularmente, se analizaron los genes stx2. Se encontraron dos secuencias con alta homología a regiones promotoras de genes eucariotas (pr1 y pr7) ubicadas upstream al marco abierto de lectura que codifica para la subunidad A y B de STX2. Para evaluar la funcionalidad de estas secuencias en un contexto eucariota se realizaron ensayos de expresión de genes indicadores. Se generaron construcciones plasmídicas en las cuales se clonó la secuencia codificante para GFP bajo el control de pr1 y pr7. Se analizaron los resultados mediante microscopía confocal. Se observó expresión de GFP en células eucariotas transfectadas con ambas construcciones, mientras que los controles transfectados con pr-GFP no mostraron fluorescencia. Por otro lado, se realizó un ensayo de citotoxicidad en células con distinta susceptibilidad a STX2 (Vero y BHK). Para ello, se realizaron transfecciones con el plásmido pGEMT conteniendo la secuencia codificante para STX2 (pStx2). Al transfectar células Vero observamos efecto citotóxico similar al observado en células incubadas con STX2 purificada (DO Stx2: 0.77 + 0.06; pStx2:0.69 + 0.07). Por otro lado, las células transfectadas con el plasmido sin inserto no mostraron citotoxicidad (DO pGEMT: 1.27 + 0.06; Vero sin tratar: 1.40 + 0.14). Al utilizar sobrenadantes de células transfectadas con pStx2 sobre células Vero naïve, se observó efecto citotóxico. Para determinar si la citotoxicidad se debía específicamente a la presencia de la proteina STX2, se utilizó un suero policlonal que neutralizó los efectos toxicos. (DO550nm-pStx2 vs DO550nm -pStx2 + anticuerpo. P