TcADKn: Una adenilato quinasa localizada en el núcleo de Trypanosoma cruzi.

CAMARA, MARIA DE LOS MILAGROS; BOUVIER, LEON; MIRANDA, MARIANA; PEREIRA, CA

CABA

Jornada; X Jornadas científicas del instituto de investigaciones médicas Alfredo Lanari; 2011

IDIM

Introducción: Las adenilato quinasas son un grupo deenzimas responsables de mantener la homeostasis celular deATP, catalizando la interconversión de nucleótidos deadenosina. Por esta razón, se encuentran ubicadas enregiones donde tienen lugar la síntesis y el consumo deATP. Las células eucariotas típicas poseen tres isoformas,mientras que en tripanosomátidos se han identificado por lomenos tres isoformas adicionales. La gran diversidad decondiciones a las que se enfrentan estos parásitos durante suciclo de vida es una posible explicación de esta diferencia.Recientemente han sido caracterizadas isoformas deadenilato quinasas nucleares en D melanogaster, Scereviciae, C. elegans y humanos. En este trabajo,presentamos el estudio de la isoforma de adenilato quinasanuclear, TcAdKN.Objetivos: Dar los primeros pasos en el estudio funcionalde una isoforma de adenilato quinasa nuclear.Metodología: Los epimastigotes (estadio replicativo noinfectivo) de Trypanosoma cruzi de la cepa CL Brener,salvajes o modificados genéticamente, se cultivan a 28°C enmedio LIT (triptosa de infusión de hígado). Para lalocalización subcelular de TcAdKN porinmunofluorescencia, los parásitos se fijan y permeabilizanpara luego incubarlos con el anticuerpo especifico yfinalmente con anticuerpo secundario asociado afluoróforos. Como marcadores de localización se utilizarán,colorante DAPI (nuclear). Para la sobre-expresión de lasproteínas de interés, se construirán modelos de parásitostransgénicos a partir de epimastigotes salvajes. Los parásitosse transfectarán mediante las técnicas clásicas, utilizandoplásmidos completamente diseñados en nuestro laboratorio.Resultados y conclusiones: A partir de la informacióndisponible sobre secuencias aminoacídicas de adenilatoquinasas nucleares de otros organismos, se buscaron sushomólogos en T.cruzi. El gen correspondiente fue clonado,se sobre-expresó en bacterias E. coli y se purificó la proteínaobtenida. Mediante análisis bioquímicos de actividadenzimática, se pudo validar la actividad de adenilato quinasay de ATPasa de dicha enzima. Para estudiar la localizaciónsubcelular, se diseñó un plásmido que expresaba la enzimaTcAdKN fusionada a GFP (proteína verde fluorescente) yse transfectaron parásitos en el estadío de epimastigotes.Luego del proceso de selección, se obtuvo como resultadodel análisis, una localización claramente nuclear yparcialmente citosólica. Para determinar la posible señal delocalización nuclear, se realizaron fusiones de distintossegmentos de la proteína a GFP. Luego de lastransfecciones, se pudo ver que los parásitos que conteníanla porción amino terminal de la proteína presentaban unadistribución nuclear, mientras que la porción carboxiloterminal mostró un patrón citosólico. Por esto, se determinóque la señal imprescindible para que TcAdkN se ubique enel núcleo se encontraría en el amino terminal de la proteína.