TCADK3: UNA ADENILATO QUINASA LOCALIZADA EN LOS GLICOSOMAS DE TRYPANOSOMA CRUZI

GIACOMETTI, ALINA; CAMARA, MARIA DE LOS MILAGROS; BOUVIER, LEÓN ALBERTO; PEREIRA, CLAUDIO

Buenos Aires

Jornada; IX Jornadas Científicas del Instituto de Investigaciones Médicas "Alfredo Lanari"; 2010

Las adenilato quinasas son un grupo de enzimas responsables de mantener la homeostasis celular de ATP, catalizando la interconversión de nucleótidos de adenosina. Por esta razón, se encuentran ubicadas en regiones donde tienen lugar la síntesis y el consumo de ATP. Las células eucariotas típicas poseen tres isoformas, mientras que en tripanosomátidos se han identificado por lo menos tres isoformas adicionales. La gran diversidad de condiciones a las que se enfrentan estos parásitos durante su ciclo de vida es una posible explicación de esta diferencia. Estos organismos tienen otra particularidad ya que poseen glicosomas, organelas de la familia de los peroxisomas donde se realiza la glucólisis, proceso que habitualmente ocurre en el citoplasma. En este trabajo, presentamos el estudio de la isoforma de adenilato quinasa de localización glicosomal, laTcAdk3. Esta contiene en su extremo carboxilo terminal una señal de localización glicosomal (PTS-1, Peroxisomal Targeting Signal) que difiere del consenso: el péptido -CKL. Objetivos: Caracterizar la Adenilato Quinasa 3 de T cruzi Metodología: Cultivos de parásitos: Epimastigotes de Trypanosoma cruzi de la cepa CL Brener (salvajes o modificados genéticamente) se cultivan a 28°C en medio LIT (triptosa de infusión de hígado) suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino y estreptomicina/penicilina. En el caso de los parásitos transgénicos se mantendrán en las mismas condiciones con el agregado de 500 µg/ml de geneticina. Localización subcelular por inmunofluorescencia: Los parásitos se fijan con una solución de PBS-formaldehído y se los permeabiliza con metanol. Se los incuba primero con el anticuerpo contra la proteína de interés y luego con un anticuerpo secundario asociado a fluoróforos. La localización de la proteína se determina por fluorescencia observando mediante un microscopio Olympus BX51. Como marcadores de localización se utilizarán, colorante DAPI (nuclear) y hexoquinasa(glicosomas) Estudios de expresión por Western Blot: Extractos proteicos de parásitos sometidos a distintos tratamientos son analizados para la expresión de las distintas fosfotransferasas los anticuerpos producidos y los protocolos clásicos de Western Blot. Construcción de parásitos transgénicos: Para la sobre-expresión de las proteínas de interés, se construirán modelos de parásitos transgénicos a partir de epimastigotes de la cepa CL Brener. Los parásitos se transfectarán, utilizando las técnicas clásicas, utilizando plásmidos completamente diseñados en nuestro laboratorio. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: a partir de la información disponible sobre secuencias aminoacídicas de adenilato quinasas, se buscaron sus homólogos en T.cruzi y se clonaron dichos genes. Particularmente, el gen de la TcAdk3 se clonó, se sobreexpresó en bacterias E.Coli y se purificó la proteína obtenida. Mediante análisis bioquímicos de actividad enzimática, se pudo validar la actividad de adenilato quinasa de dicha enzima. Para estudiar la localización subcelular, se diseñó un plásmido que expresaba la enzima fusionada a GFP (proteína verde fluorescente) y se transfectaron parásitos en el estadío de epimastigotes. Se obtuvo, como resultado, una localización glicosomal. Para determinar si el péptido -CKL era el responsable de la ubicación en glicosomas, se construyeron mutantes sin el péptido, y también se fusionó el -CKL a GFP. Luego de las transfecciones, se pudo ver que los parásitos que contenían la proteína de fusión sin la señal, presentaban una distribución citoplasmática de la misma, mientras que el péptido fusionado a GFP mostraba un patrón glicosomal. Por esto, se determinó que el -CKL es una señal imprescindible para que la TcAdk3 se ubique en glicosomas. Actualmente, se continúan realizando estudios sobre esta isoforma glicosomal.