Identificación de una adenilato quinasa nuclear en T. cruzi

CAMARA, MARIA DE LOS MILAGROS; BOUVIER, LEÓN ALBERTO; MIRANDA, MARIANA; CANEPA, GASPAR; PEREIRA, CLAUDIO

Buenos Aires

Jornada; VIII Jornadas Científicas del Instituto de Investigaciones Médicas "Alfredo Lanari"; 2009

INTRODUCCION: Las adenilato quinasas son enzimas ampliamente distribuidas en los seres vivos que entre otras funciones, son responsables de aumentar el potencial energético del ATP. Por esta razón, se encuentran ubicadas en regiones de la célula donde ocurre tanto la síntesis, como al consumo de ATP. Los tripanosomátidos son los organismos que poseen la mayor cantidad de variantes de adenilato quinasa encontradas en una única célula. Esto se podría explicar por la gran diversidad de condiciones que atraviesan estos parásitos durante su ciclo de vida. Existen pocos antecedentes de adenilato quinasas localizadas en el núcleo y su función es aún desconocida. En nuestro laboratorio hemos caracterizado funcionalmente seis isoformas de esta enzima en T. cruzi y en este trabajo presentamos una nueva variante de localización nuclear. MATERIALES Y METODOS: Epimastigotes de la cepa CL Brener fueron cultivados en medio LIT (infusión de hígado y triptosa) suplementado con suero fetal bovino. Los plásmidos de expresión utilizados son específicos para T. cruzi (pTEX). Los epimastigotes transgénicos se generaron por método de electroporación. Los resultados se evaluaron por Western blot y microscopía de fluorescencia. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: A partir del primer reporte de una adenilato quinasa muy atípica en términos de secuencia y de localización nuclear en células humanas, mediante un abordaje bioinformático logramos identificar su equivalente en T. cruzi. Considerando que su función es desconocida y que no existe información sobre el metabolismo energético del núcleo, decidimos abordar su estudio funcional. Se clonó el gen que codificaría para esta enzima, se lo sobre-expresó en bacterias y se purificó la proteína obtenida. Mediante ensayos bioquímicos de actividad enzimática, se pudo validar la proteína obtenida como una adenilato quinasa. Con el objetivo de confirmar su localización nuclear se diseño un plásmido capaz de expresar la adenilato quinasa fusionada a la proteína verde fluorescente. Una vez obtenidos los parásitos transgénicos se pudo observar una intensa señal nuclear. Sin embargo, cuando los parásitos se encontraban en un medio de cultivo pobre en nutrientes y con una tasa de replicación menor, se observó que la fluorescencia se localizaba principalmente en el citoplasma sugiriendo que existe un tráfico de esta proteína entre ambas regiones subcelulares regulada por factores extracelulares. Actualmente se están llevando a cabo ensayos para determinar la función de las adenilato quinasas nucleares, estos serian los primeros pasos en el estudio del metabolismo energético nuclear de un organismo