Purificación y caracterización parcial de una poligalacturonasa ácida inducible de Aspergillus kawachii

BYRNE, CHRISTIAN E.; ROJAS, NATALIA L.; VOGET, CLAUDIO E.; CAVALITTO, SEBASTIÁN F.

Posadas

Congreso; XII Congreso Argentino de Micología; 2011

El hongo filamentoso Aspergillus kawachii (IFO 4308) produce al menos dos poligalacturonasas (PGasas) activas a pH 2,2 cuando se cultiva en un medio líquido a base de sales, triptona y diferentes fuentes de carbono. Una de estas enzimas, PG1, es la PGasa ácida dominante en aquellos cultivos que emplean glucosa como fuente de carbono y energía. Sin embargo, cuando la fuente de carbono es pomaza de limón (rica en pectinas) se induce la síntesis de otra PGasa ácida, a la que se denominó PG1´. El presente trabajo tiene el objetivo de concentrar, purificar y determinar distintas características bioquímicas de PG1´ a fin de compararlas con las de la PG1. Aspergillus kawachii fue cultivado en un medio mineral liquido usando pomaza de limón como fuente de carbono. El cultivo se realizó en erlenmeyer agitado a 28 °C y 200 RPM durante 48 hs. Una vez finalizado, el cultivo se filtró través de tela muselina y papel de filtro Watman N°1, se concentró por evaporación a presión reducida y se sometió a una serie de separaciones cromatográficas de intercambio iónico y exclusión molecular con un equipo Akta-FPLC. La actividad PGasa se determinó empleando ácido poligalacturónico (APG) como sustrato midiendo el incremento de grupos reductores por el método de Somogyi-Nelson. Los distintos pasos del proceso de purificación fueron analizados mediante SDS-PAGE. También se realizó un isoelectroenfoque y un zimograma con un gel de agarosa para detectar las bandas activas a pH 2,2. Finalmente, la enzima purificada se utilizó para la determinación del pH óptimo para la hidrólisis de APG. El filtrado de un cultivo de A. kawachii con pomaza de limón como fuente de carbono posee actividad PGasa a pH 2,2. La concentración de este filtrado fue acompañada de una pérdida considerable de actividad total. Las separaciones cromatográficas permitieron purificar la enzima inducible PG1´ hasta la homogeneidad, a juzgar por el SDS-PAGE. El peso molecular estimado por este método fue de 66 kDa. En el isoelectroenfoque se observa una banda amplia y difusa centrada a un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,5. El zimograma permitió verificar la presencia de diversas isoenzimas. El pH óptimo para APG fue de 4,2, manteniéndose un 10% de la actividad a pH 2,2 y más de un 50 % a pH 5,0. Comparando las propiedades bioquímicas de la enzima inducible PG1´ con aquellas publicadas para la enzima constitutiva PG1 podemos detectar dos diferencias sustanciales. Una de ellas es que PG1´ presenta un punto isoeléctrico aproximadamente una unidad de pH superior, lo que justifica una buena separación de ambas mediante cromatografía de intercambio iónico. Por otro lado, PG1 es prácticamente inactiva a pH 5,0, mientas que PG1´ conserva más de la mitad de la actividad óptima a ese pH y es aún activa a pH 6,0. Por lo tanto la clasificación de las PGasas de A. kawachii en ácidas y no ácidas de acuerdo a su actividad relativa a pH~2 y 5,0, tal como se postulara en trabajos anteriores, no sería del todo correcta.