Medición de la permeabilidad al agua controlando la presión hidrostática y la composición química en ambos lados de una membrana celular

MARCELO OZU; RICARDO DORR; PAULA MUT; GABRIELA AMODEO; MARIO PARISI

Carlos Paz, Cordoba

Congreso; XXXIV Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2005

Sociedad Argentina de Biofísica

Un método muy utilizado para calcular la permeabilidad al agua en una membrana celular es a partir de los cambios de volumen que ocurren en los ovocitos de Xenopus laevis cuando son sometidos a cambios osmóticos por modificación del medio extracelular. Sin embargo, esta aproximación se ve limitada por la imposibilidad del total manejo de la composición interna del ovocito. Esta limitación fue superada por el desarrollo, en nuestro laboratorio, de una nueva técnica en la cual se coloca la membrana celular de un ovocito vaciado separando dos cámaras. Para ello, el ovocito se pega sobre una placa de acrílico y luego se lo perfora a través de un orificio presente en el soporte. Luego, utilizando un sistema de microperfusión, es posible vaciarlo total o parcialmente de su contenido intracelular. En su configuración final la membrana celular queda intacta separando dos cámaras rígidas e independientes, una de ellas cerrada herméticamente, siendo la membrana del ovocito parte de un compartimento cerrado, por lo que cualquier pasaje neto de fluido a través de ella provoca un desplazamiento de su posición. Los cambios de volumen se siguen mediante videomicroscopía, grabándose digitalmente las imágenes obtenidas. De esta forma el movimiento de agua puede ser continuamente monitoreado mientras se controla la composición química y la presión hidrostática a ambos lados de la membrana. Usando la técnica descripta se incrementó la presión hidrostática del lado intracelular en ovocitos de Xenopus laevis maduros (estadio VI) e inmaduros (estadio IV), comprobándose que el cambio de volumen relativo máximo que pueden tolerar antes de su ruptura es similar en ambos estadios (1.26±0.07 y 1.27±0.03 respectivamente), y similar a los valores informados en condiciones de estrés osmótico máximo. Sin embargo, el coeficiente de permeabilidad osmótica (unidades: 10-3 cm/s) en los ovocitos maduros (1.72±0.58, n=6) fue significativamente menor que en los ovocitos inmaduros (5.18±0.59, n=5; p<0.005). Los movimientos de agua también se midieron en ovocitos inyectados con cRNA del canal de agua acuaporina-1 (AQP-1). En este caso los ovocitos de estadio VI se inyectaron en el centro de su polo vegetal con el fin de identificar el lugar de la membrana lesionada con la aguja de inyección. Este punto fue alineado con el centro del orificio del soporte de acrílico antes del pegado y del vaciado del ovocito, lo que permite minimizar el riesgo de trabajar con membranas lesionadas para medir su permeabilidad al agua. El coeficiente de permeabilidad osmótica (unidades: 10-3 cm/s) en ovocitos que expresaron AQP-1 fue significativamente mayor que en ovocitos inyectados con agua (54.22 ± 2.85, n=3 vs 4.05 ± 0.47, n=3; p<0.001). Por otra parte este aumento fue inhibido por la presencia, en el lado extracelular, de HgCl2, un conocido inhibidor de canales de agua. La nueva técnica que presentamos abre nuevas perspectivas en la medición biofísica de la permeabilidad al agua de membranas de ovocitos que expresan acuaporinas u otros transportadores. También permite, entre otras posibilidades, estudiar la acción de inhibidores o drogas en un lado u otro de la membrana celular, los movimientos de solutos y los canales activados por estiramiento. La posibilidad de realizar en simultáneo mediciones eléctricas da acceso a un enfoque abarcador de los movimientos de agua a través de las membranas biológicas